Free Press

Jste na letišti a pálíte čas, protože zítra ráno máte odevzdat zprávu pro svého profesora. Máte svá data. Proč nevyužít čas a nevypočítat násobnou změnu exprese pro geny, které jste testovali v tom prvním experimentu qPCR, který jste provedli minulý týden?

Je to snadné – ukážu vám, jak na to.

Zkontrolujte svou metodu

Existují dva hlavní způsoby analýzy dat qPCR: analýza dvojitého delta Ct a metoda relativní standardní křivky (Pfafflova metoda). Obě metody obsahují předpoklady a mají svá omezení, takže metoda, kterou byste měli pro analýzu použít, bude záviset na vašem návrhu experimentu.

Analýza dvojitého delta Ct předpokládá, že:

• existuje stejná účinnost primerů mezi sadami primerů (tj. v rozmezí 5 %);
• existuje téměř 100% účinnost amplifikace referenčních a cílových genů;
• vnitřní kontrolní geny jsou neustále exprimovány a nejsou ovlivněny léčbou.

Metoda obecně vyhovuje experimentům s velkým počtem vzorků DNA a malým počtem testovaných genů.

Metoda relativní standardní křivky předpokládá, že:

• existuje stejná účinnost mezi kontrolními a ošetřenými vzorky.

Tato metoda funguje lépe, pokud máte méně vzorků DNA, ale větší počet testovaných genů.

Co potřebujete k analýze dvojité delty Ct

• hodnoty Ct qPCR (surová data) pro:
  • hospodářský gen: kontrolní a experimentální podmínky;
  • zajímavý gen: kontrolní a experimentální podmínky;
• tabulku Excel.

A je to! Nepotřebujete žádný drahý software.

Tady je stručné shrnutí klíčových kroků dvojité delta Ct analýzy (pro podrobné vysvětlení si přečtěte tento článek).

4 kroky pro dvojitou delta Ct analýzu

1. Provedení dvojitého delta Ct analýzy. Vezměte průměr hodnot Ct pro housekeepingový gen a testovaný gen v experimentálních a kontrolních podmínkách, čímž získáte 4 hodnoty. Tyto 4 hodnoty jsou Testovaný gen experimentální (TE), Testovaný gen kontrolní (TC), Housekeeping gen experimentální (HE) a Housekeeping gen kontrolní (HC).

Průměrná experimentální hodnota Ct	Průměrná experimentální hodnota Ct	Průměrná kontrolní hodnota Ct	Průměrná kontrolní hodnota Ct	\DeltaCt hodnota. (Experimentální)	\DeltaCt Value (Kontrolní)
TE	HE	TC	HC	\DeltaCTE	\DeltaCTC
21.27	20,23	19,60	19,27	1,03	0,33

2. Vypočtěte rozdíly mezi experimentálními hodnotami (TE – HE) a kontrolními hodnotami (TC – HC). To jsou vaše hodnoty \DeltaCt pro experimentální (\DeltaCTE) a kontrolní (\DeltaCTC) podmínky

3. Poté vypočítejte rozdíl mezi hodnotami \DeltaCT pro experimentální a kontrolní podmínky (\DeltaCTE – \DeltaCTC), abyste získali hodnotu dvojitého delta Ct (ddCt).

4. Protože všechny výpočty jsou v logaritmu o základu 2, pokaždé, když je DNA dvakrát více, vaše hodnoty Ct se sníží o 1 a nesníží se na polovinu. Abyste získali výraz fold change, musíte vypočítat hodnotu 2^{-2\Delta\Delta C_{t}}.

.

dCt hodnota (experimentální)	dCt hodnota (kontrolní)	ddCt hodnota	Změna záhybu exprese
dCTE	dCTC	ddCt	2^-ddCt
1.03	0,33	0,70	0,615572207

Co tato hodnota znamená?“

Teď, když máte svou hodnotu pro fold change, co vlastně znamená? Tato hodnota je změna záhybu vašeho zájmového genu v testovacím stavu vzhledem ke kontrolnímu stavu, který byl celý normalizován na váš housekeepingový gen.

Aby to bylo trochu jasnější – můžete si to představit jako procento. Změna v násobcích o hodnotě 1 znamená, že ve vašem testovacím stavu je exprese genu o 100 % vyšší než v kontrolním stavu – nedošlo tedy k žádné změně mezi experimentální a kontrolní skupinou. Hodnota fold-change vyšší než 1 vykazuje upregulaci zájmového genu oproti kontrolní skupině (1,2násobná změna = 120% exprese genu oproti kontrolní skupině, 5 = 500%, 10 = 1 000% atd.) Hodnoty nižší než 1 svědčí o snížení exprese genu vzhledem ke kontrole (fold change 0,5 znamená 50% expresi genu vzhledem ke kontrole, tedy poloviční expresi oproti kontrole atd.)

Tato data můžete prezentovat jako sloupcové grafy fold-change, přičemž graf kontrolních podmínek se rovná 1. Můžete také použít statistické analýzy ke kontrole významnosti změn, např. pomocí analýzy rozptylu (ANOVA) nebo t-testů, podle toho, co je vhodné pro vaše experimentální uspořádání!

Pomocí těchto kroků můžete provádět analýzu qPCR, ať jste kdekoli, i když jste na cestách. Abyste si vše ještě více usnadnili, můžete si vytvořit šablonu aplikace Excel, kterou budete pokaždé používat. Pak už budete jen zadávat data a ostatní ohromíte svou pohotovostí při provádění analýz!

Původně publikováno 9. července 2016. Recenzováno a aktualizováno 8. února 2021.

Další literatura

Livak KJ, Schmittgen TD. Analýza dat relativní genové exprese pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a 2^{-2\Delta\Delta C_{t}}. Metody. Methods. 2001;25:402-8.

.