A repülőtéren vagy, és a professzorodnak holnap reggelre beadandó jelentéssel töltöd az időt. Megvannak az adataid. Miért nem használja ki az időt, és számolja ki az expressziós hajtásváltozást azoknál a géneknél, amelyeket a múlt héten végzett első qPCR-kísérletében tesztelt?
Ez egyszerű – megmutatom, hogyan.
Check Your Method
A qPCR-adatok elemzésének két fő módja van: a kettős delta Ct-elemzés és a relatív standard görbe módszer (Pfaffl-módszer). Mindkét módszer feltételezésekkel és korlátozásokkal jár, ezért az elemzéshez használt módszer a kísérleti tervtől függ.
A kettős delta Ct elemzés feltételezi, hogy:
- a primer készletek között azonos primerhatékonyság van (pl. 5%-on belül);
- a referencia- és a célgének amplifikációs hatékonysága közel 100%-os;
- a belső kontrollgének folyamatosan expresszálódnak, és a kezelés nem befolyásolja őket.
A módszer általában olyan kísérleteket szolgál ki, amelyek nagyszámú DNS-mintát és kevés vizsgálandó gént tartalmaznak.
A relatív standardgörbe módszer feltételezi, hogy:
- a kontroll és a kezelt minták között azonos hatékonyság van.
Ez a módszer jobban működik, ha kevesebb DNS-mintával, de nagyobb számú vizsgálandó génnel rendelkezik.
Mire van szüksége a dupla delta Ct elemzéshez
- qPCR Ct értékek (nyers adatok):
- a házőrző gén: kontroll és kísérleti körülmények;
- a vizsgált gén: kontroll és kísérleti körülmények;
- egy Excel táblázat.
És ennyi! Nincs szükség drága szoftverre.
Itt van egy gyors összefoglaló a kettős delta Ct elemzés legfontosabb lépéseiről (a részletes magyarázatért olvassa el ezt a cikket).
4 lépés a kettős delta Ct elemzéshez
1. Vegyük ki a házőrző gén és a vizsgált gén Ct-értékeinek átlagát a kísérleti és a kontroll körülmények között, ami 4 értéket ad vissza. A 4 érték a következő: Kísérleti tesztelt gén (TE), kontroll tesztelt gén (TC), kísérleti házőrző gén (HE) és kontroll házőrző gén (HC).
| Átlagos kísérleti Ct-érték | Átlagos kísérleti Ct-érték | Átlagos kontroll Ct-érték | Átlagos kontroll Ct-érték | \DeltaCt Érték (Kísérleti) | \DeltaCt érték (Kontroll) |
|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC |
| 21.27 | 20.23 | 19.60 | 19.27 | 1.03 | 0.33 |
2. Számítsuk ki a kísérleti értékek (TE – HE) és a kontrollértékek (TC – HC) különbségét. Ezek a kísérleti (\DeltaCTE) és a kontroll (\DeltaCTC) körülményekre vonatkozó \DeltaCt értékek.
3. Ezután számítsa ki a kísérleti és a kontroll körülményekre vonatkozó \DeltaCt értékek különbségét (\DeltaCTE – \DeltaCTC), hogy megkapja a dupla delta Ct értéket (ddCt).
4. Mivel minden számítás a logaritmus 2-es bázisában történik, minden alkalommal, amikor kétszer annyi DNS van, a Ct-értékek 1-gyel csökkennek, és nem feleződnek. Ki kell számítania a 2^{-2\\Delta\Delta C_{t}} értékét, hogy megkapja a fold change kifejezést.
| dCt érték (kísérleti) | dCt érték (kontroll) | ddCt érték | Expression Fold Change |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0.33 | 0.70 | 0.615572207 |
Mit jelent az érték?
Most, hogy megvan a fold change értéke, mit is jelent valójában? Ez az érték az Önt érdeklő gén hajtásváltozása a vizsgálati feltételben, a kontroll feltételhez viszonyítva, ami mind normalizálva lett a házőrző génre.
Hogy egy kicsit érthetőbb legyen – gondolhat rá úgy is, mint egy százalékos értékre. Az 1 szeres változás azt jelenti, hogy 100%-ban ugyanannyi génexpresszió van a tesztfeltételben, mint a kontrollfeltételben – tehát nincs változás a kísérleti csoport és a kontrollcsoport között. Az 1 feletti fold-change érték a kontrollhoz képest az adott gén upregulációját mutatja (1,2-szeres változás = 120%-os génexpresszió a kontrollhoz képest, 5 = 500%, 10 = 1000% stb.). Az 1 alatti értékek a kontrollhoz viszonyított gén leregulációját jelzik (a 0,5-szeres változás 50%-os génexpressziót jelent a kontrollhoz viszonyítva, tehát fele akkora expressziót, mint a kontrollban, stb.).
Az adatokat fold-change oszlopdiagramok formájában is bemutathatja, a kontrollkörülményeket 1-gyel egyenlően ábrázolva. Statisztikai elemzésekkel is ellenőrizheti a változások szignifikanciáját, pl. varianciaanalízis (ANOVA) vagy t-tesztek segítségével, bármi is feleljen meg az Ön kísérleti elrendezésének!
Ezekkel a lépésekkel bárhol elvégezheti a qPCR-elemzést, még akkor is, ha éppen úton van. Hogy még egyszerűbbé tegye a dolgokat, létrehozhat egy Excel-sablont, amelyet minden alkalommal használhat. Ezután már csak be kell adnia az adatait, és meg fog lepni másokat az elemzések elvégzésében tanúsított gyorsaságával!
Eredetileg 2016. július 9-én jelent meg. Felülvizsgálták és frissítették 2021. február 8-án.
További olvasmányok
Livak KJ, Schmittgen TD. Relatív génexpressziós adatok elemzése RealTime Quantitative PCR és a 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} segítségével. Method. Methods. 2001;25:402-8.
Segített ez önnek? Akkor kérjük, ossza meg a hálózatával.
írta.