Výsledky
Zobrazení cAMP v primárních řasinkách živých buněk pomocí fluorescenčních biosenzorů představuje několik jedinečných výzev. Zaprvé, řasinky jsou malé a štíhlé, vyčnívají 2-10 µm nad povrch buňky; zadruhé, ačkoli nejsou pohyblivé, podléhají pohybu v důsledku objemového proudění v koupacím roztoku a zatřetí, bona fide ciliární signály mohou být obtížně opticky odděleny od fluorescence pozadí vycházející z buněčného těla. Ačkoli bylo již dříve popsáno několik reportérů cAMP zaměřených na řasinky (19, 24, 25), snažili jsme se vytvořit ratiometrické biosenzory s lepší jasností a věrností zaměření. Po testování mnoha návrhů jsme zjistili, že nejlepší cílení, jas a citlivost nabízejí sondy čtvrté generace na bázi Epac z laboratoře Keese Jalinka (EpacH188 a verze s vyšší afinitou, EpacH187) (26) v kombinaci s Arl13b, proteinem vysoce lokalizovaným v řasinkách (27) (obr. 1A). Senzory obsahující receptor 5-HT6 poskytovaly srovnatelně dobrou lokalizaci jako sondy spojené s Arl13b; jak je však uvedeno níže, receptory 5-HT6, které nejsou lokalizovány na řasinkách, způsobovaly zvýšení buněčného cAMP v důsledku dobře známé konstitutivní aktivity tohoto GPCR (28).
Signalizace cAMP v řasinkách digitoninem permeabilizovaných buněk. Všechny experimenty byly provedeny v intracelulárně podobném pufru doplněném o ATP a GTP. (A) Buňky mIMCD3 exprimující 5-HT6-mCherry a Arl13b-H187 lokalizované v buňce i v řasince nereagovaly na 10 µM 5-HT v těle buňky ani v řasince po 2minutovém působení 20 μg/ml digitoninu (4 experimenty, 5 řasinek). (B) Podobně se ztratila reaktivita na inverzního agonistu, 1 µM SB742457, a následná odezva na 5-HT6 v buňce i v řasince po 2 min působení 20 μg/ml digitoninu (3 experimenty, 3 řasinky). (C) Permeabilizace digitoninem zrušila signál cAMP vyvolaný 50 µM forskolinem v buněčných tělískách, ale zvýšení cAMP bylo detekovatelné v řasinkách; inhibice PDE vyvolaná 1 mM IBMX neodstranila žádný signál (n = 4 experimenty se 4 řasinkami/7 buněk). (D) Kotransfekce AC3 nezměnila odpověď na forskolin. (E) Kvantifikace a srovnání odpovědi cAMP na forskolin v buněčných tělískách a v řasinkách; **P = 0,0002, ***P = 00019. Modré stopy = buněčné tělo, červené stopy = řasinky. Časové sloupce: Časové intervaly: 3 min. Osa y je poměr 480/535 nm.
Zřejmým vysvětlením nedostatečného účinku v předchozích experimentech bylo, že cAMP se nehromadil natolik, aby byl zachycen reportérem. Když však byl stejný experiment zopakován s použitím forskolinu k přímé aktivaci endogenních AC (adenylylcykláz) přítomných v řasnaté membráně, byla zjištěna malá, ale konzistentní akumulace cAMP v mikroprostředí řasnatého tělesa, nikoli však v těle buňky (obr. 4 C a E, levé sloupcové grafy). Podobné výsledky byly získány u buněk exprimujících AC3 (36) (obr. 4 D a E, pravé sloupcové grafy), který byl při expresi v buňkách mIMCD3 lokalizován v řasinkách (příloha SI, obr. S8). Za předpokladu, že permeabilizace nevedla ke ztrátě základních složek signalizačního aparátu GPCR, malá, ale detekovatelná změna po přidání forskolinu naznačuje, že by mělo být možné rozlišit signály cAMP závislé na GPCR, pokud by probíhaly v řasince. Tyto údaje také naznačují, že řasinková membrána buněk mIMCD3 zůstala po ošetření digitoninem neporušená.
Předchozí údaje nám ponechávají otázku, proč GPCR nejsou kompetentní produkovat cAMP, jakmile jsou sekvestrovány v řasince. Předchozí studie uváděly vstup Ca2+ přes řasinkovou membránu jako důležitý regulátor organelového cAMP díky přítomnosti řasinkově specifických Ca2+-vodivých kanálů (PKD2L1 a PKD2) a Ca2+-regulovaných AC (AC1, 8, 5 a 6) (11, 16, 23, 32, 37). Bylo zjištěno, že primární řasinky buněk mIMCD3 obsahují Ca2+-inhibovatelné AC5 a/nebo AC6 (10). Proto jsme se domnívali, že vysoká klidová a Ca2+ propustnost řasinek (38, 39) by mohla být příčinou inaktivace AC spřažených s receptorem 5-HT6. Abychom tento bod lépe vyřešili, vylepšili jsme senzor tím, že jsme cílovou sekvenci Arl13b nahradili funkčním receptorem 5-HT6 a zacílili tak fúzi cAMP reportéru a GPCR přímo na řasinku (5-HT6-EpacH187). V souladu s údaji z obr. 3I a 4C, když byl 5-HT cílen výhradně na řasinku, neposkytoval měřitelný signál cAMP (obr. 5A). Vystavení buněk roztokům nominálně bez Ca2+ nezachránilo odpověď 5-HT v řasinkách (obr. 5B), což naznačuje, že vstup Ca2+ přes řasinkovou membránu signál nepotlačil. Uvažovali jsme, že možná exprese 5-HT6 změnila ciliární distribuci proteinu Gαs v buňkách mIMCD3, ale experimenty s imunobarvením naznačily, že tomu tak není (příloha SI, obr. S9). Když jsme však testovali účinek 5-HT v buňkách předem ošetřených SAG (250 nM až 1 µM) k aktivaci Smo receptorů (40), podařilo se nám obnovit reaktivitu 5-HT6 receptoru na agonistu (obr. 5C). Citlivost k inverznímu agonistovi byla rovněž patrná, což naznačuje obnovení konstitutivní aktivity (obr. 5D).
Aktivace dráhy Hedgehog zvyšuje odpověď cAMP zaznamenanou pomocí 5-HT6-Epac-H187 na 5-HT a dopamin v primárních řasinkách: (A) V souladu s údaji na obr. 3I a 4C buňky mIMCD3 nereagovaly na 10 µM 5-HT, když byla fúze senzoru a receptoru omezena striktně na řasinkovou membránu (6 experimentů, 6 řasinek). (B) Ztlumení vysokého v řasinkách umístěním buněk do roztoku nominálně bez Ca2+ nezachránilo signalizaci cAMP stimulovanou 5-HT (5 experimentů, 6 řasinek). (C) Po předléčení 1 µM SAG přes noc reagovalo na stimulaci 5-HT 5 ze 6 řasinek (6 experimentů) (**P = 0,000992). (D) Předléčení 1 µM SAG zachránilo odpověď na 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2 % pod základní hodnotou vzhledem k následnému zvýšení cAMP vyvolanému 10 µM 5-HT; typické pro 4 experimenty, 4 řasinky). (E) Zvýšení cAMP u řasinek NIH 3T3 (typické pro 9 experimentů, 11 řasinek) bylo vyvoláno 10 μM 5-HT. (F) Noční předléčení 1 μM SAG významně zvýšilo odpověď na 5-HT (**P = 0,00034; 6 experimentů, 7 řasinek). Předléčení přes noc 10 μM cyklopaminu (Cyclo) mělo zanedbatelný účinek (8 experimentů, 9 řasinek, sloupcový graf). (G a H) 100 nM somatostatinu (SST) oslabilo odpověď na 5-HT u řasinek nesoucích SSTR3-GFP s předúpravou SAG a bez ní (G: 5 experimentů, 6 řasinek; H: 2 experimenty, 5 řasinek). (I a J) Předúprava SAG zvýšila odpověď na 10 nM dopaminu (DA) (I: 4 experimenty, 4 řasinky, J: 4 experimenty, 6 řasinek, **P = 0,002476). Modré stopy, buněčné tělo; červené stopy, řasinky. Časové sloupce: 3 min. Osa y je poměr 480/535 nm FRET. Sloupcové grafy ukazují odpověď 5-HT nebo DA jako procento odpovědi na forskolin/IBMX; chybové úsečky představují SEM.
Předchozí výsledky nás postavily před otázku, zda neočekávaná na SAG závislá zvýšená regulace receptoru 5-HT6 exprimovaného v buňkách mIMCD3 byla specifická pro buněčný typ a/nebo GPCR. Na rozdíl od mIMCD3 vedla stimulace buněk 3T3 (obr. 5E) a MEF (příloha SI, obr. S10A) s 5-HT k měřitelné změně poměru, která však byla výrazně zvýšena po ošetření SAG (obr. 5F a příloha SI, obr. S10B). Zajímavé je, že antagonista vyhlazených receptorů cyklopamin, u kterého by se dal očekávat opačný účinek než u SAG, nezrušil 5-HT stimulovanou signalizaci cAMP v primárních řasinkách buněk 3T3 (sloupcový graf, obr. 5F).
Pomocí tohoto systému jsme také mohli vyhodnotit schopnost ciliárního Gαi spřaženého GPCR, SSTR3, zvrátit serotoninem stimulované signály cAMP v řasince. Ošetření buněk 3T3 koexprimujících SSTR3-GFP a 5-HT6-H187 somatostatinem zvrátilo odpovědi 5-HT zpět na výchozí hodnotu během 2 min v přítomnosti i nepřítomnosti ošetření SAG (obr. 5 G a H), což ukazuje na lokální kontrolu funkce 5-HT6. Poté jsme dále testovali, jak SAG ovlivňuje aktivitu dalšího ciliárního GPCR spřaženého s Gαs, dopaminového receptoru D1R (5). D1R-EGFP byl koexprimován s 5-HT6-H187 v buňkách 3T3 a byly vybrány buňky s fluorescencí pouze v řasinkách. Deset nanomolárů dopaminu vyvolalo v kontrolních buňkách malé, ale měřitelné signály cAMP (obr. 5I) a po ošetření SAG se signál opět výrazně zvýšil (obr. 5J; shrnuto ve sloupcovém grafu).
.