Risultati
Imaging cAMP nel cilio primario di cellule vive utilizzando biosensori fluorescenti presenta diverse sfide uniche. In primo luogo, le ciglia sono piccole e sottili, sporgendo 2-10 µm sopra la superficie della cellula; in secondo luogo, mentre non sono mobili, sono soggette a movimento a causa del flusso di massa nella soluzione di bagno, e in terzo luogo, i segnali ciliari in buona fede possono essere difficili da separare otticamente dalla fluorescenza di fondo che emana dal corpo cellulare. Mentre diversi cilium-targeted cAMP reporter sono stati descritti in precedenza (19, 24, 25), abbiamo cercato di generare biosensori raziometrici con luminosità migliorata e fedeltà di targeting. Dopo aver testato numerosi disegni, abbiamo trovato il miglior targeting, la luminosità e la sensibilità sono stati offerti dalla quarta generazione di sonde Epac-based dal laboratorio di Kees Jalink (EpacH188 e una versione più alta affinità, EpacH187) (26) combinato con Arl13b, una proteina altamente localizzata alle ciglia (27) (Fig. 1A). Sensori che incorporano il recettore 5-HT6 ha dato localizzazione comparabilmente buona come Arl13b-accoppiato sonde; Tuttavia, come discusso di seguito, 5-HT6 recettori non localizzati alle ciglia causato elevazione del cAMP cellulare a causa della ben nota attività costitutiva di questo GPCR (28).
cAMP segnalazione in cilia di digitonina-permeabilizzato cellule. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in intracellulare-come buffer integrato con ATP e GTP. (A) mIMCD3 cellule che esprimono 5-HT6-mCherry e Arl13b-H187 localizzato sia alla cella e cilium non ha risposto a 10 µM 5-HT nel corpo cellulare o nel cilium dopo 2 min trattamento con 20 μg/mL digitonina (4 esperimenti, 5 cilia). (B) Allo stesso modo, la reattività all’agonista inverso, 1 µM SB742457, e la successiva risposta di rimbalzo 5-HT6 sono state perse sia nella cellula che nel cilium dopo 2 minuti di trattamento con 20 μg/mL di digitonina (3 esperimenti, 3 cilia). (C) Digitonina permeabilizzazione ablato il 50 µM forskolin indotto segnale cAMP nei corpi cellulari, ma aumento cAMP era rilevabile in cilia; 1 mM IBMX indotta PDE inibizione non ha smascherato alcun segnale (n = 4 esperimenti con 4 cilia/7 cellule). (D) AC3 cotrasfezione non ha cambiato la risposta forskolin. (E) Quantificazione e confronto della risposta cAMP a forskolin in corpi cellulari e in cilia; **P = 0.0002, ***P = 00019. Tracce blu = corpo cellulare, tracce rosse = cilia. Barre del tempo: 3 min. L’asse y è il rapporto 480/535 nm.
Una spiegazione ovvia per la mancanza di effetto negli esperimenti precedenti era che cAMP non si accumula abbastanza per essere catturato dal reporter. Tuttavia, quando lo stesso esperimento è stato ripetuto usando la forskolina per attivare direttamente le AC endogene (adenilciclasi) presenti nella membrana ciliare, un piccolo ma consistente accumulo di cAMP è stato rilevato nel microambiente del cilium ma non nel corpo cellulare (Fig. 4 C ed E, grafici a barra sinistra). Risultati simili sono stati ottenuti in cellule che esprimono AC3 (36) (Fig. 4 D ed E, grafici a barre di destra), che è stato localizzato alle ciglia quando espresso in cellule mIMCD3 (Appendice SI, Fig. S8). Supponendo che la permeabilizzazione non ha portato alla perdita di componenti essenziali del meccanismo di segnalazione GPCR, il cambiamento piccolo ma rilevabile dopo l’aggiunta di forskolina suggerisce che dovrebbe essere stato possibile risolvere GPCR-dipendenti segnali cAMP sono stati a prendere posto nel cilium. Questi dati indicano anche che la membrana ciliare delle cellule mIMCD3 è rimasta intatta dopo il trattamento con digitonina.
I dati precedenti ci lasciano con la domanda sul perché i GPCR non sono competenti a produrre cAMP una volta sequestrati nel cilium. Studi precedenti hanno citato l’ingresso del Ca2+ attraverso la membrana ciliare come un importante regolatore del cAMP dell’organello grazie alla presenza di canali di conduzione del Ca2+ specifici per le ciglia (PKD2L1 e PKD2) e AC regolati dal Ca2+ (AC1, 8, 5 e 6) (11, 16, 23, 32, 37). È stato riportato che le ciglia primarie delle cellule mIMCD3 ospitano AC5 e/o AC6 inibite dal Ca2+ (10). Abbiamo quindi considerato che l’alta permeabilità a riposo e Ca2+ del cilium (38, 39) potrebbe spiegare l’inattivazione delle AC accoppiate al recettore 5-HT6. Per affrontare meglio questo punto, abbiamo migliorato il sensore sostituendo la sequenza di targeting Arl13b con un funzionale recettore 5-HT6 per indirizzare il cAMP reporter-GPCR fusione direttamente al cilium (5-HT6-EpacH187). Coerentemente con i dati delle Figg. 3I e 4C, quando mirato esclusivamente al cilium, 5-HT non ha prodotto un segnale misurabile cAMP (Fig. 5A). L’esposizione delle cellule a nominalmente Ca2 + soluzioni libere non ha salvato la risposta 5-HT in cilia (Fig. 5B), indicando che Ca2 + ingresso attraverso la membrana ciliare non sopprime il segnale. Abbiamo considerato che forse l’espressione di 5-HT6 ha alterato la distribuzione ciliare della proteina Gαs nelle cellule mIMCD3, ma gli esperimenti di immunostaining hanno suggerito che questo non è il caso (Appendice SI, Fig. S9). Tuttavia, quando abbiamo testato l’effetto della 5-HT in cellule pretrattate con SAG (da 250 nM a 1 µM) per attivare i recettori Smo (40), siamo stati in grado di ripristinare la reattività del recettore 5-HT6 all’agonista (Fig. 5C). La sensibilità all’agonista inverso era anche evidente, implicando il ripristino dell’attività costitutiva (Fig. 5D).
L’attivazione della via Hedgehog aumenta la risposta cAMP riportato da 5-HT6-Epac-H187 a 5-HT e dopamina in cilia primarie: (A) Coerentemente con i dati delle Figg. 3I e 4C, le cellule mIMCD3 non hanno risposto a 10 µM 5-HT quando la fusione sensore/recettore era confinata strettamente alla membrana ciliare (6 esperimenti, 6 cilia). (B) Attenuare l’alto in cilia ponendo le cellule in una soluzione nominalmente priva di Ca2+ non ha salvato la segnalazione cAMP stimolata da 5-HT (5 esperimenti, 6 cilia). (C) Dopo il pretrattamento notturno con 1 µM SAG, 5 su 6 cilia (6 esperimenti) hanno risposto alla stimolazione 5-HT (**P = 0.000992). (D) Il pretrattamento con 1 µM SAG ha salvato la risposta a 1 µM SB742257 (-35.5 ± 11.2% sotto la linea di base rispetto al successivo aumento di cAMP provocato da 10 µM 5-HT; tipico di 4 esperimenti, 4 cilia). (E) Un aumento di cAMP in NIH 3T3 cilia (tipico di 9 esperimenti, 11 cilia) è stato causato da 10 μM 5-HT. (F) Pretrattamento durante la notte con 1 μM SAG significativamente aumentato 5-HT risposta (**P = 0.00034; 6 esperimenti, 7 cilia). Pretrattamento durante la notte con 10 μM ciclopamina (Cyclo) ha avuto un effetto trascurabile (8 esperimenti, 9 cilia, grafico a barre). (G e H) La somatostatina 100 nM (SST) ha attenuato la risposta alla 5-HT nelle cilia che ospitano SSTR3-GFP con e senza pretrattamento SAG (G: 5 esperimenti, 6 cilia; H: 2 esperimenti, 5 cilia). (I e J) pretrattamento SAG aumentato la risposta 10 nM dopamina (DA) (I: 4 esperimenti, 4 cilia, J: 4 esperimenti, 6 cilia, **P = 0.002476). Tracce blu, corpo cellulare; tracce rosse, cilia. Barre del tempo: 3 min. L’asse y è il 480/535 nm rapporto FRET. I grafici a barre indicano la risposta 5-HT o DA come percentuale della risposta forskolin/IBMX; barre di errore rappresentano SEM.
I risultati precedenti ci hanno lasciato con la domanda se l’inaspettato SAG-dipendente up-regolazione del recettore 5-HT6 espresso in cellule mIMCD3 era di tipo cellulare e / o GPCR specifico. A differenza di mIMCD3, la stimolazione delle cellule 3T3 (Fig. 5E) e MEFs (Appendice SI, Fig. S10A) con 5-HT prodotto un cambiamento misurabile rapporto che è stato, tuttavia, significativamente migliorata dopo il trattamento SAG (Fig. 5F e Appendice SI, Fig. S10B). È interessante notare che l’antagonista del recettore lisciato ciclopamina, che potrebbe essere previsto per avere l’effetto opposto di SAG, non ha abolito 5-HT-stimolato segnalazione cAMP in cilia primaria di cellule 3T3 (grafico a barre, Fig. 5F).
Utilizzando questo sistema, siamo stati anche in grado di valutare la capacità di un ciliare Gαi-accoppiato GPCR, SSTR3, per invertire i segnali cAMP stimolati dalla serotonina nel cilium. Il trattamento delle cellule 3T3 che coesprimono SSTR3-GFP e 5-HT6-H187 con somatostatina ha invertito le risposte alla 5-HT riportandole alla linea di base entro 2 minuti in presenza e in assenza del trattamento SAG (Fig. 5 G e H), indicando un controllo locale della funzione 5-HT6. Abbiamo poi testato ulteriormente come SAG ha influenzato l’attività di un altro GPCR ciliare accoppiato a Gαs, il recettore D1R della dopamina (5). D1R-EGFP è stato coespresso con 5-HT6-H187 in cellule 3T3, e sono state selezionate le cellule con fluorescenza solo nelle ciglia. Dieci nanomolari di dopamina hanno prodotto piccoli ma misurabili segnali di cAMP nelle cellule di controllo (Fig. 5I), e di nuovo, il segnale è stato significativamente aumentato dopo il trattamento SAG (Fig. 5J; riassunto nel grafico a barre).