Výsledky a diskuse
Uvádí se, že konjugace Spirogyry je vyvolána snížením obsahu dusíku nebo jeho vyčerpáním (Grote 1977; Yamashita a Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Proto jsme se nejprve pokusili vyvolat konjugaci vyčerpáním dusíku z kultivačního média. To však bylo neúspěšné. Grote (1977) uvádí, že konjugace byla indukována v čistém anorganickém klosterním médiu a že důležitá byla hodnota pH. Přestože jsme řasová vlákna inkubovali v médiu o různém pH, konjugaci jsme nevyvolali. Navíc další pokusy, různé teploty a vyčerpání různých živin, byly neúspěšné. Bylo zjištěno, že u některých druhů rodu Spirogyra byla konjugace indukována inkubací řasových vláken při trvalém osvětlení (Yamashita a Sasaki 1979). V našich materiálech se však konjugace neprojevila, ani když byla vlákna inkubována bez zdroje dusíku při nepřetržitém osvětlení po dobu 2 týdnů. Po výše uvedených různých pokusech se nám nakonec podařilo vyvolat konjugaci inkubací vláken na agarové plotně připravené pomocí APW při 23 °C v cyklu 12:12 h L-D po dobu 4 dnů. Během inkubace se na distálním konci terminálních buněk vytvořil také tyčinkovitý rhizoid. Když byla vlákna na agarové plotně inkubována ve tmě, konjugační jev nebyl vyvolán. Allen (1958) uvedl, že konjugace byla vyvolána inkubací na agarové plotně. Udržovala zásobní kulturu s použitím Pringsheimova půdně-vodního média (Pringsheim 1946) v režimu 16 h světla (chladná bílá zářivka) – 8 h tmy při teplotě přibližně 20 °C. Pro indukci páření bylo několik vláken přeneseno na 1,5% Difco agar připravený s použitím destilované vody a inkubováno při teplotě přibližně 20 °C v cyklu 16:8 h světla a dne. Po několikadenní inkubaci se na agarové destičce vytvořily zygospory. Ačkoli se světelné podmínky a teplota během inkubace lišily, Allenova metoda (1958) se v zásadě shodovala s naší metodou. Dále jsme analyzovali faktory zodpovědné za indukci konjugace na agarové plotně, a to následovně:
Přemýšleli jsme, zda je za indukci konjugace zodpovědná nějaká neznámá kontaminující látka (látky) obsažená v agarovém prášku. Tuto možnost jsme zkoumali následujícím experimentem. Práškový agar (Wako, Osaka, Japonsko) byl suspendován v APW a uchováván při 4 °C za míchání přes noc. Po odstředění (185×g, 10 min) byla výsledná peleta dvakrát promyta APW centrifugací. Konečná agarová peleta byla suspendována v čerstvém APW a byly připraveny destičky. Na této agarové plotně byla úspěšně indukována konjugace. Když byla řasová vlákna inkubována v supernatantu získaném promytím agarového prášku, konjugace nebyla vůbec indukována (údaje nejsou uvedeny). Za indukci konjugace tedy byla zodpovědná inkubace na agarové desce, ale nikoli rozpustný kontaminant.
Protože APW neobsahoval dusíkaté chemické látky, neměla by agarová deska obsahovat žádný nebo jen velmi málo dusíku. Proto bylo možné, že oba faktory, umístění na agarové plotně a vyčerpání dusíku, působily při indukci synergicky. Abychom tuto možnost prověřili, inkubovali jsme vlákna na agarové desce připravené pomocí APW doplněného o 1 mM KNO3. Na této agarové plotně byla konjugace rovněž indukována (obr. 1a), což naznačuje, že vyčerpání dusíku není zodpovědné za indukci konjugace. Dále byla konjugace indukována, když byla vlákna inkubována na agarové desce připravené pomocí klosteriového média, které obsahovalo různé živiny (obr. 1b). Tyto výsledky jednoznačně naznačily, že umístění na agarové plotně jako takové je faktorem zodpovědným za indukci konjugace.
Vliv KNO3 a klosteriového média na zahájení konjugace na agarové plotně. Přibližně 100 vláken bylo inkubováno na agarových plotnách připravených pomocí APW, APW doplněného o 1 mM KNO3 nebo klosteriového média při 23 °C v cyklu 12:12 h L-D po dobu 4 dnů. Když byla pozorována papila, usoudili jsme, že buňka začala konjugovat. Výsledky byly prezentovány jako poměr počtu filament, která začala tvořit konjugační trubičku, k celkovému počtu filament. Pokusy byly třikrát opakovány a údaje jsou prezentovány jako průměr a směrodatná chyba průměru (SEM)
Indukce konjugace na agarové plotně byla zkoumána i u jiného druhu, S.fuluviatilis, který po rozříznutí řasových vláken diferencoval rhizoid (údaje nejsou uvedeny) jako v případě S. castanacea. U tohoto druhu byla konjugace rovněž indukována při inkubaci na agarové plotně připravené pomocí APW. Konjugaci na agarové plotně jsme dále zkoumali u tří druhů rodu Spirogyra, které nerozlišovaly rhizoid. S.ellipsospora Transeau byla v laboratoři udržována jako kontaminant kultury Chara. Další dvě Spirogyra sp. odebrané z jezera Biwa byly udržovány jako axenická kultura po dobu 6 měsíců. Všechny tři druhy Spirogyra nevykazovaly konjugaci při inkubaci na agarové plotně.
U některých druhů Spirogyra byla konjugace vyvolána snížením nebo vyčerpáním obsahu dusíku (Grote 1977; Yamashita a Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Kromě obsahu dusíku musela být u S. majuscule kontrolována intenzita světla a/nebo pH (Grote 1977). U S. castanacea a S. fuluviatilis byla účinná inkubace na agarové plotně a vyčerpání dusíku nebylo nutné (tato studie). Na druhé straně Agrawal a Singh (2002) uvádějí, že Spirogyra sp. nezačala konjugovat na 2-10% agarové plotně. To bylo podobné našim výsledkům získaným u Spirogyra sp., které nerozlišovaly rhizoid. Faktory nezbytné pro indukci konjugace jsou tedy u jednotlivých druhů rodu Spirogyra značně variabilní. Zajímalo nás, zda je za indukci konjugace na agarové plotně zodpovědná inhibice růstu. Během inkubace na agarové plotně připravené pomocí APW nebo klosteriového média se buňky množily buněčným dělením na obou agarových plotnách, když buňky nezačaly tvořit papilu konjugační trubice. Inhibice růstu tedy nebyla spouštěčem konjugace.
Pro zkoumání přítomnosti typu páření mezi vlákny byla monoklonální kultura S. castanacea podrobena indukci konjugace. Po 48hodinové inkubaci byly u jednoho vlákna zjištěny dva typy konjugace (obr. 2a-c). Obrázek 2b ukazuje buňky indukované skalární konjugací (hrot šipky na obr. 2a). Obr. 2c naopak ukazuje buňky indukované laterální konjugací (šipka na obr. 2a). Po laterální konjugaci se normálně vytvořily zygospory (obr. 2d). Yamagishi (1977) uvádí, že u S.castanacea je obvykle pozorována skalární konjugace, zatímco laterální byla pozorována zřídka. Náš výsledek byl v souladu s výsledkem Yamagishiho (1977). V rámci našich znalostí je však indukce skalariformní i laterální konjugace v jednom vlákně (obr. 2a) první zprávou. Při párování dvou vláken se ve většině případů všechny buňky jednoho vlákna chovaly jako samčí a buňky druhého vlákna jako samičí. Velmi vzácně se však zygospory tvořily v obou vláknech (obr. 3). Párovací typ tedy není přinejmenším u S.castanacea fixován. Hypnozygoty vznikaly inkubací na agarové plotně po dobu asi 1 měsíce. Bylo však obtížné reprodukovatelně vyvolat klíčení přidáním klosterního média. Je třeba najít metodu, jak reprodukovatelně vyvolat klíčení.
Indukce skalárních i laterálních konjugací ve stejném vlákně. a Skalární i laterální konjugace se vytvořily ve stejném vlákně po 48hodinové inkubaci. b Větší zvětšení buněk vykazujících skalariformní konjugaci v bodě a (hlava šipky). c Větší zvětšení buněk vykazujících laterální konjugaci v bodě a (šipka). d Zygospory vzniklé laterální konjugací po 96 h inkubace. Sloupce 50 μm
Konjugace v klonové kultuře. Po 96hodinové inkubaci na agarové plotně se vytvořily zygoty. Zygospory se tvořily v obou vláknech. Bar 50 μm
Zkoumali jsme identifikaci extracelulárních materiálů vylučovaných během procesu páření pomocí různých lektinů u S. castanacea. Z 19 zkoumaných lektinů (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL a WGA) barvily BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I a SBA reprodukční buňky, ale ne vegetativní buňky (tab. 1). Yoon et al. (2009) uvádí, že tři lektiny, Con A, RCA a UEA, vykazovaly značné značení na extracelulárních materiálech u S. varians (Hassall) Kützing. Zdá se tedy, že materiály vázající lektiny vylučované během konjugace se u jednotlivých druhů do určité míry liší. Již dříve jsme uvedli, že BSL-I a jacalin vykazovaly v rhizoidu kontrastní vzorce barvení: jacalin jasně obarvil obrys rhizoidu, zatímco barvení BSL-I bylo rozptýlené (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Předpokládalo se, že materiál vázající BSL-I je zodpovědný za adhezi vláken k substrátu. Na druhé straně se spekulovalo, že materiál vázající jacalin se podílí na rozpoznávání substrátu (Ikegaya et al. 2008b). V této studii jsme proto zaměřili pozornost na BSL-I a jacalin (obr. 4). Po 48hodinové inkubaci na agarové plotně se na vlákně znázorněném na obr. 4a vytvořily papily v různých směrech. Předpokládali jsme, že toto vlákno zahájilo tvorbu papil v nepřítomnosti partnerského vlákna. BSL-I silně obarvil povrch papil. Septa mezi buňkami byla rovněž silně obarvena. Dále jsme obarvili dvojici filament, která začala konjugovat po 48 h inkubace. Na obr. 4b jsme usoudili, že horní filament je samčí gameta a dolní samičí gameta, protože průměr dolních buněk filamentu se zvětšuje oproti hornímu filamentu. Konjugační trubičky prodloužené z párových buněk byly silně obarvené, zatímco celý povrch buněk samičí gamety byl slabě obarvený (obr. 4b′). Po 72hodinové inkubaci byl celý povrch buněk samčí gamety rovněž slabě zbarven (obr. 4c′). Po 96 hodinách inkubace na agarové plotně se vytvořily zygospory (obr. 4d). Konjugační trubičky byly silně obarvené (obr. 4d′), zatímco povrch zygospor nebyl obarven. Dále bylo zkoumáno barvení jacalinem. Buňky filamentů na obr. 3e tvořily papily ve stejném směru. Předpokládali jsme, že toto vlákno zahájilo konjugaci v přítomnosti partnerského vlákna a při přenosu na sklíčko došlo k jeho ztrátě. Papily byly silně obarveny jacalinem (obr. 4e′). Během procesu konjugace se jacalinem barvily především konjugační kanálky (obr. 4f′-h′). Byl rovněž zkoumán vzor barvení pomocí Con A, RCA-I a SBA (údaje nejsou uvedeny). Con A silně barvil septa mezi zygosporami vytvořenými v samičí gametě, zatímco papily velmi slabě. Když se vytvořily zygospory, vzor barvení pomocí RCA-I nebo SBA byl podobný jako u BSL-I, jak ukazuje obr. 4d′.
Tabulka 1
Průzkum různých lektinů pro vazbu na vegetativní a reprodukční buňky Spirogyracastanacea
.
| Lectiny | Vegetativní buňky | Reprodukční buňky | Specifičnost |
|---|---|---|---|
| BSL-I | × | ○ | Gal α, GalNAc α |
| Con A | × | ○ | Man α, Glc α |
| Jacalin | × | ○ | Sialyl-Gal β1-3 GalNAc-O- |
| RCA I | × | ○ | Gal, GalNAc |
| SBA | × | ○ | GalNAc |
| WGA | × | × | (GlcNAc)n, kyselina sialová |
Buňky byly obarveny (○), nebyly obarveny vůbec (×)
Zachycení vláken v procesu pohlavního rozmnožování pomocí BSL-I a jacalinu. Filamenta inkubovaná na agarové plotně byla obarvena buď fluoresceinem značeným BSL-I, nebo jacalinem (a′-h′). Jsou také zobrazeny mikrofotografie v jasném poli (a-h). a′-d′ barvení pomocí BSL-I. Po 48hodinové inkubaci na agaru se vytvořily papily v různých směrech (a, a′) nebo začala konjugovat vlákna (b, b′). Konjugovaná vlákna po 72 hodinách inkubace (c, c′). Po 96 h inkubace se vytvořily zygoty (d, d′). e′-h′ barvení jacalinem. Po 48 h inkubaci na agaru se vytvořily papily ve stejném směru (e, e′) nebo začala konjugovat filamenta (f, f′). Konjugovaná vlákna po 72 hodinách inkubace (g, g′). Po 96 h inkubace se vytvořily zygoty (d, d′). Bar 50 μm
Zkoumali jsme vliv šesti lektinů, BSL-I, Con A, jacalinu, RCA-I, SBA a WGA, na konjugaci. Vlákna byla předem inkubována v APW doplněném jedním z lektinů po dobu 1 dne. Poté byla přenesena na agarovou desku doplněnou stejným lektinem a inkubována po dobu 4 dnů. Bylo zjištěno, že jacalin silně inhiboval tvorbu zygospor, ale ostatní ne (údaje nejsou uvedeny). Systematická analýza ukázala, že jacalin silně inhiboval krok na samém počátku; začátek tvorby papil (obr. 5). Dále byla zkoumána reverzibilita inhibice jacalinem. Vlákna byla postupně inkubována v APW doplněném jacalinem po dobu 1 dne a poté v APW bez jacalinu po dobu 1 dne. Poté byla inkubována na agarové plotně bez jacalinu po dobu 4 dnů. Papila se však vůbec nevytvořila. Tato ireverzibilní inhibice mohla být způsobena silnou vazbou jacalinu. Yoon et al. (2009) uvedli, že RCA a UEA inhibují konjugaci. Neidentifikovali však, v jakém kroku k inhibici dochází. Ačkoli BSL-I, RCA-I, Con A a SBA také obarvily konjugační trubičku, její tvorbu neinhibovaly. Role materiálů rozpoznávaných BSL-I, RCA-I nebo SBA je cílem budoucích studií.
Vliv lektinů na zahájení tvorby konjugační trubičky. Asi 100 vláken bylo inkubováno v APW doplněném buď 1 μg/ml BSL-I, Con A, jacalinu, RCA-I, SBA nebo WGA při 23 °C v cyklu 12:12 h L-D po dobu 1 dne a poté byla přenesena na agarovou plotnu doplněnou stejným lektinem a inkubována po dobu 4 dnů. Když byla pozorována papila, usoudili jsme, že buňka zahájila konjugaci. Výsledky byly reprezentovány jako poměr počtu filament, která začala tvořit konjugační trubičku, k celkovému počtu filament. Pokusy byly opakovány 4krát a údaje jsou reprezentovány jako průměr a SEM
Randhawa (1959) naznačil podobnost konjugačních procesů a tvorby rhizoidů: podílí se na nich kontaktní podnět. Na druhé straně se Kniep (1928) domníval, že konjugační procesy jsou v podstatě způsobeny chemickým podnětem (citováno v Randhawa (1959)). Konjugační trubice i rhizoid začínají tvorbou papily a mohou se prodlužovat růstem špičky. Konjugační trubice se však tvoří na boku, ale rhizoid se tvoří na distálním konci buňky (Nagata 1973). Jacalin jasně obarvil obrys konjugační trubice (obr. 3e′-h′) i rhizoidu (Ikegaya et al. 2008b). Jacalin neinhiboval tvorbu rhizoidu, ale inhiboval diferenciaci na rhizoid ve tvaru růžice (Ikegaya et al. 2008b). V případě konjugačních trubiček však jacalin inhiboval tvorbu papily jako takové (obr. 5). Zdá se, že role materiálu vázajícího jacalin je u konjugační trubice a rhizoidu odlišná.
Úspěch v reprodukovatelné indukci konjugace v laboratoři otevřel cestu k systematickým analýzám konjugace u Spirogyra, jako je určení mechanismu pohlavnosti buněk, role lektinových vazebných materiálů, mechanismu pohybu samčího protoplastu.