Wyniki i dyskusja
Donoszono, że koniugacja Spirogyra jest indukowana przez obniżenie zawartości azotu lub jego zubożenie (Grote 1977; Yamashita i Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Dlatego najpierw próbowaliśmy indukować koniugację przez zubożenie podłoża hodowlanego w azot. To jednak nie powiodło się. Grote (1977) podał, że koniugacja była indukowana w czystym nieorganicznym podłożu closterium i że wartość pH była istotna. Mimo, że inkubowaliśmy włókna glonów w podłożu o różnym pH, koniugacja nie została wywołana. Ponadto, inne próby, różne temperatury i pozbawienie różnych składników odżywczych, nie powiodły się. Podano, że koniugacja była indukowana przez inkubację włókien glonów pod ciągłym oświetleniem u niektórych gatunków Spirogyra (Yamashita i Sasaki 1979). Jednakże, nasze materiały nie wykazywały koniugacji, nawet gdy włókna były inkubowane bez źródła azotu w ciągłym oświetleniu przez 2 tygodnie. Po wielu próbach, w końcu udało nam się wywołać koniugację poprzez inkubację włókien na płytce agarowej przygotowanej z APW w 23°C w cyklu L-D 12:12 przez 4 dni. Podczas inkubacji na dystalnym końcu komórek terminalnych tworzyły się również rizoidy w kształcie pręcików. Gdy filamenty na płytce agarowej inkubowano w ciemności, zjawisko koniugacji nie było indukowane. Allen (1958) doniósł, że koniugacja była indukowana przez inkubację na płytce agarowej. Hodowlę utrzymywała przy użyciu podłoża gruntowo-wodnego Pringsheima (Pringsheim 1946) w reżimie 16 h światła (chłodna biała świetlówka) – 8 h ciemności w temperaturze około 20°C. W celu indukcji kojarzenia, kilka włókien przenoszono na 1,5% agar Difco przygotowany przy użyciu wody destylowanej i inkubowano w temperaturze około 20°C w cyklu L-D 16:8. Po kilkudniowej inkubacji na płytce agarowej formowały się zygospory. Chociaż warunki świetlne i temperatura podczas inkubacji były różne, metoda Allena (1958) była zasadniczo taka sama jak nasza. Dalej analizowaliśmy czynniki odpowiedzialne za indukcję koniugacji na płytce agarowej, jak poniżej.
Zastanawialiśmy się, czy jakieś nieznane zanieczyszczenie(a) zawarte w proszku agarowym było odpowiedzialne za indukcję koniugacji. Zbadaliśmy tę możliwość za pomocą następującego eksperymentu. Proszek agarowy (Wako, Osaka, Japonia) został zawieszony w APW i przechowywany w temperaturze 4°C pod mieszaniem przez noc. Po odwirowaniu (185×g, 10 min), otrzymany osad przemywano 2-krotnie APW przez wirowanie. Końcowy osad agarowy zawieszano w świeżej APW i przygotowywano płytki. Koniugacja została pomyślnie wywołana na tej płytce agarowej. Gdy włókna glonów inkubowano w supernatancie uzyskanym z przemywania proszku agarowego, koniugacja nie była w ogóle indukowana (dane nie pokazane). Tak więc to inkubacja na płytce agarowej, a nie rozpuszczalne zanieczyszczenia, była odpowiedzialna za indukcję koniugacji.
Ponieważ APW nie zawierała związków azotowych, płytka agarowa powinna nie zawierać azotu lub zawierać go bardzo mało. Dlatego możliwe było, że oba czynniki, lokalizacja na płytce agarowej i pozbawienie azotu, działały synergistycznie w indukcji. Aby sprawdzić tę możliwość, inkubowaliśmy filamenty na płytce agarowej przygotowanej z APW uzupełnionej 1 mM KNO3. Na tej płytce koniugacja była również indukowana (Rys. 1a), co wskazuje, że zubożenie azotu nie jest odpowiedzialne za indukcję koniugacji. Ponadto, koniugacja była indukowana, gdy filamenty inkubowano na płytce agarowej przygotowanej z użyciem pożywki closterium, zawierającej różne składniki pokarmowe (Rys. 1b). Wyniki te jednoznacznie wskazują, że lokalizacja na płytce agarowej per se jest czynnikiem odpowiedzialnym za indukcję koniugacji.
Wpływ KNO3 i pożywki closterium na rozpoczęcie koniugacji na płytce agarowej. Około 100 filamentów inkubowano na płytkach agarowych przygotowanych z użyciem APW, APW uzupełnionego 1 mM KNO3 lub pożywki closterium w 23°C w cyklu L-D 12:12 h przez 4 dni. Po zaobserwowaniu brodawek oceniano, że komórka rozpoczęła koniugację. Wyniki przedstawiono jako stosunek liczby filamentów, które rozpoczęły tworzenie rurki koniugacyjnej do całkowitej liczby filamentów. Eksperymenty powtarzano 3 razy, a dane przedstawiono jako średnią i błąd standardowy średniej (SEM)
Indukcję koniugacji na płytce agarowej badano u innego gatunku, S. fuluviatilis, który różnicował rizoidy po przecięciu włókien glonów (dane nie pokazane), podobnie jak w przypadku S. castanacea. U tego gatunku koniugacja była również indukowana po inkubacji na płytce agarowej przygotowanej z APW. Koniugację na płytce agarowej badaliśmy także u trzech gatunków Spirogyra, które nie różnicowały rizoidów. S.ellipsospora Transeau była utrzymywana w laboratorium jako zanieczyszczenie hodowli Chara. Pozostałe dwie Spirogyra sp. zebrane z jeziora Biwa były utrzymywane jako kultury akseniczne przez 6 miesięcy. Wszystkie trzy Spirogyra nie wykazywały koniugacji przez inkubację na płytce agarowej.
W niektórych gatunkach Spirogyra, koniugacja była indukowana przez obniżenie lub zubożenie zawartości azotu (Grote 1977; Yamashita i Sasaki 1979; Simons et al. 1984). U S. majuscule, oprócz zawartości azotu, należało kontrolować intensywność światła i/lub pH (Grote 1977). W przypadku S. castanacea i S. fuluviatilis inkubacja na płytce agarowej była skuteczna i nie było konieczne uszczuplanie azotu (niniejsze badania). Z drugiej strony, Agrawal i Singh (2002) podali, że Spirogyra sp. nie rozpoczynała koniugacji na 2-10% płytce agarowej. Były to podobne wyniki do uzyskanych przez nas u Spirogyra sp., która nie różnicowała rizoidów. Tak więc czynniki niezbędne do indukcji koniugacji są bardzo zróżnicowane wśród gatunków Spirogyra. Zastanawialiśmy się, czy za indukcję koniugacji na płytce agarowej odpowiedzialne jest zahamowanie wzrostu. Podczas inkubacji na płytce agarowej przygotowanej na podłożu APW lub closterium, komórki proliferowały poprzez podziały komórkowe na obu płytkach agarowych, podczas gdy komórki nie rozpoczynały formowania brodawki rurki koniugacyjnej. Tak więc, zahamowanie wzrostu nie było czynnikiem wyzwalającym koniugację.
Aby zbadać obecność typu kojarzeniowego między filamentami, monoklonalną kulturę S. castanacea poddano indukcji koniugacji. Po 48 h inkubacji stwierdzono dwa typy koniugacji w tym samym filamencie (Ryc. 2a-c). Na ryc. 2b przedstawiono komórki indukujące koniugację skalarną (grot strzałki na ryc. 2a). Z kolei na ryc. 2c pokazano komórki indukujące koniugację boczną (strzałka na ryc. 2a). Zygospory formowały się normalnie po koniugacji bocznej (Rys. 2d). Yamagishi (1977) podał, że koniugacja skalarna jest powszechnie obserwowana u S.castanacea, podczas gdy koniugacja boczna występuje rzadko. Nasze wyniki były zgodne z wynikami Yamagishi (1977). Jednakże, w granicach naszej wiedzy, indukcja zarówno koniugacji skalarnej, jak i lateralnej w tym samym filamencie (Rys. 2a) jest pierwszym doniesieniem. Gdy dwa filamenty łączyły się w pary, w większości przypadków wszystkie komórki jednego filamentu zachowywały się jak męskie, a drugiego jak żeńskie. Bardzo rzadko jednak zygospory powstawały w obu filamentach (ryc. 3). Tak więc typ kojarzenia nie jest stały, przynajmniej u S. castanacea. Hypnozygoty powstawały w wyniku inkubacji na płytce agarowej przez około 1 miesiąc. Trudno było jednak w sposób powtarzalny indukować kiełkowanie przez dodanie do nich pożywki closterium. Należy znaleźć metodę powtarzalnego indukowania kiełkowania.
Indukcja koniugacji skalarnych i bocznych w tym samym filamencie. a Zarówno koniugacje skalarne, jak i boczne zostały uformowane w tym samym filamencie po 48 h inkubacji. b Większe powiększenie komórek ukazujących koniugację skalarną w a (głowa strzałki). c Większe powiększenie komórek ukazujących koniugację boczną w a (strzałka). d Zygospory utworzone poprzez koniugację boczną po 96 h inkubacji. Słupki 50 μm
Koniugacja w hodowli klonów. Po 96 h inkubacji na płytce agarowej powstawały zygoty. Zygospory tworzyły się w obu filamentach. Bar 50 μm
Przy użyciu różnych lektyn u S. castanacea badaliśmy identyfikację materiałów zewnątrzkomórkowych wydzielanych podczas procesu krycia. Spośród 19 badanych lektyn (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL i WGA), BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I i SBA wybarwiały komórki rozrodcze, ale nie wegetatywne (Tabela 1). Yoon i wsp. (2009) podali, że trzy lektyny, Con A, RCA i UEA, wykazywały znaczące znakowanie na materiałach zewnątrzkomórkowych u S. varians (Hassall) Kützing. Wydaje się więc, że materiały wiążące lektyny wydzielane podczas koniugacji różnią się do pewnego stopnia między gatunkami. Wcześniej donosiliśmy, że BSL-I i jacalina wykazywały kontrastujące wzory barwienia w kłączu: jacalina wyraźnie barwiła kontury kłącza, podczas gdy barwienie BSL-I było rozproszone (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). Sugerowano, że materiał wiążący BSL-I jest odpowiedzialny za adhezję filamentów do podłoża. Z drugiej strony, przypuszczano, że materiał wiążący jacalinę jest zaangażowany w rozpoznawanie podłoża (Ikegaya i wsp. 2008b). Dlatego w niniejszej pracy skupiliśmy naszą uwagę na BSL-I i jacalinie (Rys. 4). Po 48 h inkubacji na płytce agarowej, włókno pokazane na Rys. 4a tworzyło brodawki w różnych kierunkach. Przypuszczano, że filament ten rozpoczął formowanie brodawek przy braku filamentu partnerskiego. BSL-I silnie wybarwił powierzchnię brodawek. Septy między komórkami były również silnie wybarwione. Następnie wybarwiliśmy parę filamentów, które rozpoczęły koniugację po 48 h inkubacji. Na ryc. 4b oceniono, że górny filament jest gametą męską, a dolny żeńską, ponieważ średnica dolnych komórek filamentu staje się większa niż górnego. Rurki koniugacyjne wydłużone z komórek sparowanych były silnie wybarwione, natomiast cała powierzchnia komórek gamety żeńskiej była słabo wybarwiona (Rys. 4b′). Po 72 h inkubacji cała powierzchnia komórek gamety męskiej była również słabo wybarwiona (Rys. 4c′). Po 96 h inkubacji na płytce agarowej uformowały się zygospory (Rys. 4d). Rurki koniugacyjne były silnie wybarwione (Rys. 4d′), natomiast powierzchnia zygospor nie była wybarwiona. Następnie badano barwienie jacaliną. Komórki filamentów z Rys. 3e tworzyły brodawki w tym samym kierunku. Spekulowano, że filament ten rozpoczął koniugację w obecności filamentu partnerskiego i został utracony podczas przenoszenia na szkiełko podstawowe. Brodawki były silnie wybarwione jacaliną (ryc. 4e′). W trakcie procesu koniugacji jacalina wybarwiała głównie kanały koniugacyjne (ryc. 4f′-h′). Zbadano również wzór barwienia Con A, RCA-I i SBA (dane nie pokazane). Con A silnie wybarwiał przegrody między zygosporami powstającymi w gametach żeńskich, natomiast brodawki bardzo słabo. Gdy zygospory były uformowane, wzór barwienia z RCA-I lub SBA był podobny do tego z BSL-I, jak pokazano na Rys. 4d′.
Tabela 1
Badanie różnych lektyn pod kątem wiązania do komórek wegetatywnych i reprodukcyjnych Spirogyracastanacea
.
| Lektyny | Komórki wegetatywne | Komórki rozrodcze | Szczególność |
|---|---|---|---|
| BSL-.I | × | ○ | Gal α, GalNAc α |
| Con A | × | ○ | Man α, Glc α |
| Jakalina | × | ○ | Sialyl-Gal β1-3 GalNAc-O- |
| RCA I | × | ○ | Gal, GalNAc |
| SBA | × | ○ | GalNAc |
| WGA | × | × | (GlcNAc)n, kwas sialowy |
Komórki wybarwione (○), nie wybarwione w ogóle (×)
Utrzymanie włókien w procesie rozmnażania płciowego z BSL-I i jacaliną. Filamenty inkubowane na płytce agarowej barwiono znakowanym fluoresceiną BSL-I lub jacaliną (a′-h′). Mikrofotografie jasnego pola są również pokazane (a-h). a′-d′ barwienie BSL-I. Po 48 h inkubacji na agarze formowały się brodawki w różnych kierunkach (a, a′) lub włókna rozpoczynały koniugację (b, b′). Skoniugowane filamenty po 72 h inkubacji (c, c′). Po 96 h inkubacji uformowały się zygoty (d, d′). e′-h′ barwienie jacaliną. Po 48 h inkubacji na agarze, brodawki formowały się w tym samym kierunku (e, e′), lub filamenty rozpoczynały koniugację (f, f′). Skoniugowane filamenty po 72 h inkubacji (g, g′). Po 96 h inkubacji uformowały się zygoty (d, d′). Bar 50 μm
Badamy wpływ sześciu lektyn, BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA i WGA, na koniugację. Filamenty były preinkubowane w APW z dodatkiem jednej z lektyn przez 1 dzień. Następnie przenoszono je na płytkę agarową z dodatkiem tej samej lektyny i inkubowano przez 4 dni. Stwierdzono, że jacalina silnie hamowała tworzenie zarodników, podczas gdy inne lektyny nie (dane nie pokazane). Analiza systematyczna wykazała, że jacalina silnie hamowała etap samego pocz±tku; pocz±tek formowania brodawki (Rys. 5). Następnie zbadano odwracalno¶ć inhibicji przez jacalinę. Filamenty inkubowano kolejno w APW z dodatkiem jacaliny przez 1 dzień, a następnie w APW bez jacaliny przez 1 dzień. Następnie inkubowano je na płytce agarowej pozbawionej koszenili przez 4 dni. Jednakże brodawki nie były w ogóle formowane. Ta nieodwracalna inhibicja może być spowodowana silnym wiązaniem się jakaliny. Yoon i wsp. (2009) wykazali, że RCA i UEA hamują koniugację. Nie zidentyfikowali jednak, na którym etapie dochodzi do inhibicji. Chociaż BSL-I, RCA-I, Con A i SBA również barwią rurkę koniugacyjną, to nie hamują jej tworzenia. Rola materiałów rozpoznawanych przez BSL-I, RCA-I lub SBA jest celem przyszłych badań.
Wpływ lektyn na początek formowania rurki koniugacyjnej. Około 100 filamentów inkubowano w APW z dodatkiem 1 μg/ml BSL-I, Con A, jacaliny, RCA-I, SBA lub WGA w 23°C w cyklu L-D 12:12 h przez 1 dzień, a następnie przenoszono na płytkę agarową z dodatkiem tej samej lektyny i inkubowano przez 4 dni. Po zaobserwowaniu brodawek oceniano, że komórka rozpoczęła koniugację. Wyniki przedstawiano jako stosunek liczby filamentów, które rozpoczęły tworzenie rurki koniugacyjnej do całkowitej liczby filamentów. Doświadczenia powtórzono 4 razy, a dane przedstawiono jako średnią i SEM
Randhawa (1959) zasugerował podobieństwo procesów koniugacji i tworzenia rizoidów: zaangażowany jest bodziec kontaktowy. Z drugiej strony, Kniep (1928) uważał, że procesy koniugacji są zasadniczo wynikiem działania bodźca chemicznego (cyt. w Randhawa (1959)). Zarówno rurka koniugacyjna jak i rizoid rozpoczynają się poprzez formowanie brodawki i mogą się wydłużać poprzez wzrost wierzchołka. Jednakże rurka koniugacyjna powstaje na brzegu, a ryzoid na dystalnym końcu komórki (Nagata 1973). Jakalina wyraźnie zabarwiła kontury zarówno rurki koniugacyjnej (Rys. 3e′-h′), jak i rizoidu (Ikegaya et al. 2008b). Jakalina nie hamowała tworzenia się rizoidu, ale hamowała różnicowanie się do rizoidu w kształcie rozety (Ikegaya i in. 2008b). Natomiast w przypadku rurek koniugacyjnych, jakakalina hamowała formowanie brodawki per se (Rys. 5). Wydaje się, że rola materiału wiążącego jacalinę jest inna w rurce koniugacyjnej i rizoidzie.
Sukces w powtarzalnej indukcji koniugacji w laboratorium otworzył drogę do systematycznych analiz koniugacji u Spirogyra, takich jak określenie mechanizmu płciowości komórek, roli materiału wiążącego lektyny, mechanizmu przemieszczania się protoplastu męskiego.