Free Press

Eredmények és vita

A Spirogyra konjugációját a nitrogéntartalom csökkentése vagy kimerítése indukálja (Grote 1977; Yamashita és Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Ezért először a tenyészközeg nitrogénszintjének csökkentésével próbáltuk a konjugációt előidézni. Ez azonban sikertelen volt. Grote (1977) arról számolt be, hogy a konjugációt tiszta szervetlen klosztériumos táptalajban indukálták, és hogy a pH-érték fontos volt. Bár az algafilamentumokat különböző pH-jú közegben inkubáltuk, a konjugációt nem indukáltuk. Ezenkívül más kísérletek, különböző hőmérsékletek és különböző tápanyagok kimerítése is sikertelen volt. Arról számoltak be, hogy a Spirogyra egyes fajainál a konjugációt folyamatos megvilágításban inkubált algafilamentumok indukálták (Yamashita és Sasaki 1979). A mi anyagaink azonban nem mutattak konjugációt, még akkor sem, amikor a filamentumokat nitrogénforrás nélkül, folyamatos megvilágítás mellett inkubáltuk 2 hétig. A fenti különböző kísérletek után végül úgy sikerült konjugációt előidéznünk, hogy a filamentumokat APW felhasználásával készített agarlemezen 23°C-on, 12:12 órás L-D ciklusban inkubáltuk 4 napon keresztül. Az inkubáció során a terminális sejtek disztális végén rúd alakú rizoid is képződött. Amikor az agarlemezen lévő filamentumokat sötétben inkubálták, a konjugációs jelenség nem indukálódott. Allen (1958) arról számolt be, hogy a konjugációt agarlemezen történő inkubálás indukálta. Ő Pringsheim-féle talaj-víz táptalajjal (Pringsheim 1946) 16 órás fény (hideg fehér fénycső)-8 órás sötét rendszerben, kb. 20°C-on tartotta az alaptenyészetet. A párosodás indukálásához néhány filamentumot desztillált vízzel készített 1,5%-os Difco agarra helyezett át, és 16:8 órás L-D ciklusban, kb. 20°C-on inkubálta. Néhány napos inkubáció után zigospórák képződtek az agarlemezen. Bár az inkubáció során a fényviszonyok és a hőmérséklet eltérő volt, Allen (1958) módszere alapvetően megegyezett a mi módszerünkkel. A továbbiakban az agarlemezen történő konjugáció indukciójáért felelős tényezőket a következők szerint elemeztük.

Az agarporban található ismeretlen szennyezőanyag(ok) felelős(ek) a konjugáció indukciójáért. Ezt a lehetőséget a következő kísérlettel vizsgáltuk. Az agarport (Wako, Osaka, Japán) APW-ben szuszpendáltuk, és egy éjszakán át 4°C-on kevergetés mellett tartottuk. Centrifugálás (185×g, 10 perc) után az így kapott pelletet kétszer mostuk APW-vel centrifugálással. A végleges agar pelletet friss APW-ben szuszpendáltuk, és lemezeket készítettünk. A konjugációt sikeresen indukáltuk ezen az agarlemezen. Amikor az algafilamentumokat az agarpor mosásával nyert felülúszóban inkubáltuk, a konjugációt egyáltalán nem indukáltuk (az adatok nem láthatóak). Így az agarlemezen történő inkubáció, nem pedig az oldható szennyezőanyag volt felelős a konjugáció indukálásáért.

Mivel az APW nem tartalmazott nitrogéntartalmú vegyszereket, az agarlemeznek nem vagy csak nagyon kevés nitrogént kellett tartalmaznia. Ezért lehetséges volt, hogy mindkét tényező, az agárlemezen való elhelyezkedés és a nitrogénhiány szinergikusan hatott az indukcióban. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatához 1 mM KNO3-mal kiegészített APW-vel készített agárlemezen inkubáltuk a filamentumokat. Ezen az agarlemezen a konjugáció szintén indukálódott (1a. ábra), ami azt jelzi, hogy a nitrogén kimerülése nem felelős a konjugáció indukciójáért. Továbbá a konjugációt indukálták, amikor a fonalakat különböző tápanyagokat tartalmazó closterium táptalajjal készített agarlemezen inkubálták (1b. ábra). Ezek az eredmények egyértelműen jelezték, hogy az agarlemezen való elhelyezkedés önmagában felelős a konjugáció indukciójáért.

A konjugáció indukcióját agarlemezen más fajoknál, a S. fuluviatilisnél is vizsgáltuk, amely az algafilamentumok elvágásakor rizoidot differenciált (az adatok nem láthatóak), mint a S. castanacea esetében. Ennél a fajnál is indukálták a konjugációt az APW-vel készített agarlemezen történő inkubáláskor. A konjugációt agarlemezen tovább vizsgáltuk három Spirogyra esetében, amelyek nem differenciáltak rizoidot. A S.ellipsospora Transeau-t a laboratóriumban a Chara kultúra kontaminánsaként tartottuk fenn. A Biwa-tóból gyűjtött másik két Spirogyra sp. 6 hónapig axenikus kultúraként volt fenntartva. Mindhárom Spirogyra nem mutatott konjugációt agarlemezen történő inkubálással.

Néhány Spirogyra fajnál a konjugációt a nitrogéntartalom csökkentése vagy kimerítése indukálta (Grote 1977; Yamashita és Sasaki 1979; Simons és mtsai. 1984). A S. majuscule esetében a nitrogéntartalom mellett a fényintenzitást és/vagy a pH-t is szabályozni kellett (Grote 1977). A S. castanacea és a S. fuluviatilis esetében az agarlemezen történő inkubálás hatékony volt, és nem volt szükség a nitrogén kimerítésére (jelen vizsgálat). Másrészt Agrawal és Singh (2002) arról számolt be, hogy a Spirogyra sp. 2-10%-os agarlemezen nem kezdett el konjugálódni. Ez hasonló volt a Spirogyra sp. esetében kapott eredményeinkhez, amely nem differenciált rizoidot. A konjugáció indukciójához szükséges tényezők tehát a Spirogyra fajok között nagyon eltérőek. Kíváncsiak voltunk, hogy a növekedés gátlása felelős-e a konjugáció indukciójáért agarlemezen. Az APW vagy closterium táptalajjal készített agárlemezen történő inkubáció során a sejtek mindkét agárlemezen sejtosztódás útján szaporodtak, amikor a sejtek nem kezdték meg a konjugációs cső papillájának kialakulását. A növekedés gátlása tehát nem volt a konjugáció kiváltója.

A filamentumok közötti párosodási típus jelenlétének vizsgálatára a S. castanacea monoklonális kultúráját konjugáció indukciójának vetettük alá. A 48 órás inkubációt követően ugyanabban a filamentumban kétféle konjugációtípust találtunk (2a-c. ábra). A 2b. ábra a sejtek által indukált szkaláris konjugációt mutatja (nyílhegy a 2a. ábrán). Másrészt a 2c. ábra a sejtek által indukált laterális konjugációt mutatja (nyíl a 2a. ábrán). A zigospórák a laterális konjugációt követően normálisan képződtek (2d. ábra). Yamagishi (1977) arról számolt be, hogy a S.castanacea esetében általában a szkaláris konjugáció figyelhető meg, míg a laterális ritkán. A mi eredményünk összhangban volt Yamagishi (1977) eredményével. Ismereteink határain belül azonban a skalariform és laterális konjugáció indukciója egyazon filamentumban (2a. ábra) az első jelentés. Amikor két filamentum párosodott, az egyik filamentum összes sejtje hímként, a másik filamentum sejtjei pedig nőstényként viselkedtek a legtöbb esetben. Nagyon ritkán azonban mindkét filamentumban zigospórák képződtek (3. ábra). A párosodási típus tehát legalábbis a S.castanacea esetében nem rögzített. A hipnozigóta az agarlemezen kb. 1 hónapig tartó inkubálással alakult ki. Nehéz volt azonban reprodukálhatóan csírázást indukálni a closterium táptalaj hozzáadásával. Módszert kell találni a csírázás reprodukálható előidézésére.

Vizsgáltuk a párzási folyamat során szekretált extracelluláris anyagok azonosítását különböző lektinek segítségével a S. castanacea esetében. A vizsgált 19 lektin (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL és WGA) közül a BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I és SBA a reproduktív sejteket festette meg, a vegetatív sejteket nem (1. táblázat). Yoon és munkatársai (2009) arról számoltak be, hogy három lektin, a Con A, az RCA és az UEA jelentős jelölést mutatott az extracelluláris anyagokon a S. varians (Hassall) Kützingben. Úgy tűnik tehát, hogy a konjugáció során szekretált lektinkötő anyagok bizonyos mértékig különböznek a fajok között. Korábban már beszámoltunk arról, hogy a BSL-I és a jacalin ellentétes festődési mintázatot mutatott a rhizoidban: a jacalin egyértelműen megfestette a rhizoid körvonalát, míg a BSL-I festődése diffúz volt (Inoue és mtsai. 1999, Ikegaya és mtsai. 2008b). Azt feltételezték, hogy a BSL-I-hez kötődő anyag felelős a filamentumok szubsztrátumhoz való tapadásáért. Másrészt feltételezték, hogy a jacalin-kötő anyag a szubsztrátum felismerésében vesz részt (Ikegaya és mtsai. 2008b). Jelen vizsgálatban ezért a BSL-I-re és a jacalinra összpontosítottuk figyelmünket (4. ábra). Agárlemezen történő 48 órás inkubációt követően a 4a. ábrán látható filamentum különböző irányú papillákat képzett. Feltételeztük, hogy ez a filamentum a partnerfilamentum hiányában kezdte el a papillák képződését. A BSL-I erősen megfestette a papillák felületét. A sejtek közötti szepta szintén erősen festett volt. Ezután megfestettünk egy pár filamentumot, amely 48 órás inkubáció után kezdett el konjugálódni. A 4b. ábrán úgy ítéltük meg, hogy a felső filamentum hím ivarsejt, az alsó pedig nőstény ivarsejt, mivel a filamentum alsó sejtjeinek átmérője nagyobb, mint a felső filamentumé. A páros sejtekből megnyúlt konjugációs csövek erősen, míg a nőstény ivarsejt teljes sejtfelülete gyengén festődött (4b′ ábra). 72 órás inkubáció után a hím ivarsejt teljes sejtfelszíne szintén gyengén festődött (4c′ ábra). Agárlemezen történő 96 órás inkubáció után zigospórák képződtek (4d. ábra). A konjugációs csövek erősen megfestődtek (4d. ábra′), míg a zigospórák felszíne nem volt megfestve. Ezután a jacalinnal történő festést vizsgáltuk. A 3e. ábrán látható fonalak sejtjei ugyanabban az irányban papillákat képeztek. Feltételeztük, hogy ez a filamentum egy partnerfilamentum jelenlétében kezdte meg a konjugációt, és a tárgylemezre való átvitel során elveszett. A papillák erősen megfestődtek jacalinnal (4e′ ábra). A konjugáció folyamata során a jacalin főként a konjugációs csatornákat festette meg (4f′-h′ ábra). A Con A, RCA-I és SBA festődési mintázatát is megvizsgáltuk (az adatok nem láthatóak). A Con A erősen megfestette a női ivarsejtekben képződött zigospórák közötti szeptákat, míg a papillákat nagyon gyengén. Amikor zigospórák képződtek, az RCA-I vagy az SBA festődési mintázata hasonló volt a BSL-I-hez, amint azt a 4d′ ábra mutatja.

Hat lektin, a BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA és WGA konjugációra gyakorolt hatását vizsgáltuk. A filamentumokat a lektinek valamelyikével kiegészített APW-ben előinkubáltuk 1 napig. Ezután ugyanezzel a lektinnel kiegészített agarlemezre helyeztük át őket, és 4 napig inkubáltuk őket. Megállapítottuk, hogy a jacalin erősen gátolta a zigospóraképződést, de a többi nem (az adatok nem láthatóak). A szisztematikus elemzés azt mutatta, hogy a jacalin súlyosan gátolta a legelején lévő lépést; a papilla kialakulásának kezdetét (5. ábra). Ezután a jacalin általi gátlás reverzibilitását vizsgáltuk. A filamentumokat egymás után 1 napig jacalinnal kiegészített APW-ben, majd 1 napig jacalint nem tartalmazó APW-ben inkubáltuk. Ezután jacalint nem tartalmazó agarlemezen inkubáltuk őket 4 napig. Papilla azonban egyáltalán nem képződött. Ezt az irreverzibilis gátlást a jacalin erős kötődése okozhatta. Yoon és munkatársai (2009) arról számoltak be, hogy az RCA és az UEA gátolta a konjugációt. Nem azonosították azonban a gátlás lépését. Bár a BSL-I, RCA-I, Con A és SBA is megfestette a konjugációs csövet, nem gátolták annak kialakulását. A BSL-I, RCA-I vagy SBA által felismert anyagok szerepe a jövőbeni vizsgálatok célpontja.

Randhawa (1959) a konjugációs folyamatok és a rizoidképződés hasonlóságát javasolta: kontakt stimulusról van szó. Másrészt Kniep (1928) úgy vélte, hogy a konjugációs folyamatok alapvetően kémiai ingerre vezethetők vissza (idézi Randhawa (1959)). Mind a konjugációs cső, mind a rizoid a papilla kialakulásával indul, és a csúcsnövekedés révén megnyúlhat. A konjugációs cső azonban a szárnyon, a rizoid azonban a sejt disztális végén alakul ki (Nagata 1973). A jakalin egyértelműen megfestette mind a konjugációs cső (3e′-h′ ábra), mind a rizoid körvonalát (Ikegaya és mtsai. 2008b). A jazalin nem gátolta a rizoid kialakulását, de gátolta a rozetta alakú rizoiddá differenciálódást (Ikegaya és mtsai. 2008b). A konjugációs csövek esetében azonban a jacalin gátolta a papilla kialakulását önmagában (5. ábra). Úgy tűnik, hogy a jacalin-kötőanyag szerepe eltérő a konjugációs csőben és a rizoidban.

A konjugáció laboratóriumban történő reprodukálható indukciójának sikere utat nyitott a Spirogyra-ban történő konjugáció szisztematikus elemzése előtt, mint például a sejtek szexualitásának meghatározási mechanizmusa, a lektinkötőanyagok szerepe, a hím protoplaszt mozgási mechanizmusa.