Převážná většina postupů IHC/ICC využívá fixaci tkání a buněk pomocí fixativ na bázi formaldehydu. Níže uvedený protokol popisuje techniku výroby 4% roztoku formaldehydu v PBS. Nejúčinnější fixační prostředek je třeba určit experimentálně.
Upozornění: Formaldehyd je toxický. Před prací s touto chemikálií si přečtěte bezpečnostní list. Měly by se používat rukavice a ochranné brýle a roztoky by se měly připravovat v digestoři.
Před zahájením si prosím přečtěte celý protokol.
Potřebná činidla
- Deionizovaná H2O
- HCl (zředěná)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldehyd v prášku
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materiály
- Filtrační jednotky
- Skleněné nádobí a míchací tyč (určená pro roztok formaldehydu)
- Rukavice a ochrana očí
- Horká deska s magnetickým míchadlem
- Termometr
- Ventilační digestoř
.
Postup
- Pro 1 l 4% formaldehydu, přidejte 800 ml 1X PBS do skleněné kádinky na míchací desce ve větrané digestoři. Zahřejte za stálého míchání na teplotu přibližně 60 °C. Dávejte pozor, aby roztok nezačal vřít.
- Do zahřátého roztoku PBS přidejte 40 g práškového paraformaldehydu.
- Prášek se v roztoku okamžitě nerozpustí. Pomalu zvyšujte pH přidáváním 1 N NaOH po kapkách z pipety, dokud roztok nezprůhlední.
- Po rozpuštění paraformaldehydu je třeba roztok ochladit a přefiltrovat.
- Objem roztoku upravte na 1 L pomocí 1X PBS.
- Překontrolujte pH a upravte ho malým množstvím zředěné HCl přibližně na hodnotu 6.
- Přidáním 1 N NaOH do roztoku se zvýší pH.9.
- Roztok lze alikvotovat a zmrazit nebo uchovávat při teplotě 2-8 °C po dobu až jednoho měsíce.
Rozdíl mezi paraformaldehydem, formaldehydem a formalinem
Paraformaldehyd (chemický název je polyoxymethylen) je prášek polymerizovaného formaldehydu, který sám o sobě nedokáže fixovat tkáně. Aby byl paraformaldehyd použitelný jako fixační prostředek na tkáně, musí být rozpuštěn v horké vodě, aby se z něj stal roztok formaldehydu. Formalin je nasycený roztok formaldehydu ve vodě (37 % hmotnostních, 40 % objemových) obsahující 10-15 % metanolu. Methanol se přidává za účelem zpomalení polymerace na formaldehyd, což snižuje fixační schopnost formalinu. Formalin lze také vyrobit ve formě bez alkoholu z práškového paraformaldehydu
.