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A grande maioria dos procedimentos de IHC/ICC emprega a fixação de tecidos e células usando fixadores baseados em formaldeído. O protocolo abaixo descreve a técnica de geração de uma solução de formaldeído a 4% em PBS. O fixador mais eficaz deve ser determinado experimentalmente.

Cautela: Formaldeído é tóxico. Por favor, leia a MSDS antes de trabalhar com este produto químico. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e soluções feitas dentro de um capuz de fumaça.

Por favor, leia o protocolo na sua totalidade antes de começar.

Procedimento

1. Para 1 L de Formaldeído a 4%, Adicione 800 mL de 1X PBS a um copo de vidro numa placa de agitação numa campânula ventilada. Aquecer enquanto se mexe até aproximadamente 60 °C. Tome cuidado para que a solução não ferva.
2. Adicionar 40 g de pó de paraformaldeído à solução aquecida de PBS.
3. O pó não se dissolve imediatamente na solução. Aumente lentamente o pH adicionando 1 N NaOH gota a gota de uma pipeta até a solução se dissolver.
4. Após a dissolução do paraformaldeído, a solução deve ser arrefecida e filtrada.
5. Ajuste o volume da solução para 1 L com 1X PBS.
6. Reveja o pH, e ajuste-o com pequenas quantidades de HCl diluído para aproximadamente 6.9.
7. A solução pode ser aliquotada e congelada ou armazenada a 2-8 °C por até um mês.

A diferença entre paraformaldeído, formaldeído e formalin

Paraformaldeído (nome químico é polioximetileno) é um pó de formaldeído polimerizado que por si só não consegue fixar tecidos. Para ser utilizável como fixador de tecidos, o paraformaldeído tem de ser dissolvido em água quente para se tornar uma solução de formaldeído. O formaldeído é uma solução saturada de formaldeído em água (37% em peso, 40% em volume) contendo 10-15% de metanol. O metanol é adicionado para retardar a polimerização do formaldeído, o que reduz o poder de fixação do formaldeído. A formalina também pode ser feita numa forma livre de álcool a partir de paraformaldeído em pó.