Free Press

Abstract

Acetyleringsmekanismerne for flere udvalgte typiske substrater fra eksperimenter, herunder arylaminer og arylhydraziner, er undersøgt med tæthedsfunktionel teori i denne artikel. Resultaterne viser, at alle overgangstilstande er karakteriseret ved en fireleddet ringstruktur, og hydralazin (HDZ) er det mest potente substrat. Bioaktiviteten for alle forbindelserne øges i en sekvens af PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. Konjunktionseffekten og delokaliseringen af N-atomets lone par spiller en afgørende rolle i reaktionen. Alle resultater er i overensstemmelse med de eksperimentelle data.

1. Introduktion

Arylamin-N-acetyltransferaserne (NAT’er, EC 2.3.1.5) er fase II-metabolismeenzymer, der findes i både prokaryoter og eukaryoter . N-acetyleringsreaktionen fører til afgiftning af arylamin xenobiotika og leder i sidste ende til elektrofile arylnitreniumioner, som anses for at være ansvarlige for DNA-adduktdannelse . Til mennesker viser de to funktionelle NAT-isozymer, NAT1 og NAT2, store forskelle i substratspecificitet og vævsfordeling på trods af 81 % aminosyresekvensidentitet . Sidstnævnte, NAT2, udtrykkes fortrinsvis i lever og tarmepitel . Tidligere undersøgelser har antaget, at NAT’er katalyserer en acetyloverførsel ved hjælp af en klassisk ping-pong-kinetisk mekanisme (skema 1). Stedbestemt mutageneseanalyse af human NAT2 og Salmonella typhimurium NAT (StNAT) tydede på, at en cysteinrest i det aktive sted var ansvarlig for formidlingen af acetyleringsprocessen. Nylige kinetiske undersøgelser af p-nitrophenylacetat (PNPA) og NAT2 i præ-stady-state og steady-state viste, at den katalytiske mekanisme for NAT2 kan afhænge af dannelsen af et thiolat-imidazoliumpar. Selv om enzymet findes i både eukaryoter og prokaryoter, er NAT’s endogene rolle stadig uklar . Substratbestemmelsen viste, at både arylaminer og arylhydraziner kunne acetyleres af NATs . De nødvendige trin i acetyloverførselsreaktionen består af acetylgruppeoverførsel fra cysteinresterne på det aktive sted til substratet og fjernelse af en proton fra sidstnævnte til førstnævnte. I denne artikel foreligger en detaljeret teoretisk undersøgelse af arylamin- og arylhydrazinsubraters adfærd ved acetylering, herunder egenskaberne ved deres strukturer, overgangstilstandene og energiprofilerne.

2. Metoder

Alle beregninger blev udført med den tæthedsfunktionelle teori (DFT) B3LYP-metode som implementeret i Gaussian03 programpakke , som tidligere er blevet anvendt med succes på en række enzymatiske systemer . Når 6-31G* og 6-311+G (3df, 2p) basissæt blev anvendt, blev B3LYP-hybridfunktionen foretrukket frem for Hartree-Fock (HF) og MP2-metoder . Selv om B3LYP-metoden nogle gange fejler i behandlingen af dispersionsrige interaktioner, er den blevet anvendt med succes på mange biologiske systemer .

Geometrierne for alle reaktanterne, mellemprodukterne og produkterne er optimeret på B3LYP/6-31G* teoriniveau. De mest stabile konformationer samt deres energier ved alle ligevægts- og overgangstilstande er blevet udregnet. Frekvensberegninger er udført for alle de resulterende stationære punkter, og hver overgangstilstand har kun én imaginær frekvens. Desuden anvendes MP2/6-311+G**-metoden på de optimerede strukturer af stationære punkter for at opnå mere nøjagtige energiprofiler. Hvis det ikke er specielt påpeget, henviser alle de følgende energianalyser til resultaterne fra MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d)-beregninger.

3. Resultater og diskussion

3.1. Substraternes grænseobitutter

Seks substrater, p-aminobenzoesyre(PABA), 4-methoxylanilin(4-MA), 4-aminosalicylat(4-AS), 5-aminosalicylat(5-AS), isoniazid(INZ), hydralazin(HDZ), er udvalgt i henhold til referencerne , som kan opdeles i to forskellige familier: arylaminer og arylhydraziner. Energierne for grænseobitaler (herunder HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 og LUMO+2) for alle seks substrater er anført i tabel 1, som anses for at spille vigtige roller i bioenzymatiske systemer . For arylaminerne reduceres HOMO-energierne i en sekvens af 4-MA > 5-AS > 5-AS > PABA > 4-AS, hvilket indikerer en forøgelse af deres nukleofile reaktivitet. Blandt alle de seks substrater (se figur 1 i det supplerende materiale, der er tilgængeligt online på doi: 10.1155/2009/783035) har INZ det største energigap mellem HOMO og LUMO, hvilket tyder på dets stabilitet. Resultaterne af Natural Population Analysis (NPA) viste, at de aktive amino-N-atomer for arylaminfamilien er mere elektronegative end dem i hydrazingruppen, hvilket hovedsagelig skyldes konjugationseffekten.

Men selv om PABA og 4-AS har forskellige substitutioner på p-siden af aminogruppen ved den seks-ledede ring, er deres bioaktivitet næsten den samme. En intermolekylær H-binding vil stabilisere selve substratet med et energitab på ca. 19-21 kJ/mol. Både HOMO- og LOMO-energierne for 5-AS er højere end for 4-A𝑆s, hvilket tyder på, at førstnævnte er mere reaktiv end sidstnævnte.

For arylhydrazinsubstraterne vil det ensomme par af N-atomerne ved den seks-ledede rings rygrad blive delokaliseret i hele systemet for at øge dets stabilitet. 𝐸(𝐿-𝐻)-værdierne for HDZ er 0,0318 a.u. højere end for INZ’s, hvilket indikerer dets højere reaktivitet end sidstnævnte.

3.2. De forskellige veje og overgangstilstande

I princippet kan alle substrater reagere med cysteinresten på det aktive sted via en samordnet vej eller en trinvis vej. Til førstnævnte oplever overgangstilstandene (se figur 1 og 2, con-ts) en samordnet overførsel af hydrogenet H5 til S1-atomet af cystein og en bindingsdannelse mellem N4- og C2-atomer. Bruddet af gamle bindinger (N4H5 og S1C2) og dannelsen af nye bindinger (C2N4 og S1H5) finder sted samtidig. Reaktanterne og målprodukterne er forbundet af den eneste overgangstilstand på den potentielle energioverflade (PES). De vigtigste strukturdata for alle overgangstilstande er anført i tabel 1 i det supplerende materiale. For den trinvise mekanisme vil H5-atomet først blive overført til O3-atomet i carbonylgruppen med tendens til at generere en ny binding mellem N4- og C2-atomet via overgangstilstand stw-ts1. Derefter dannes der et thiolesterintermediat (intmed). Følgelig vil den anden migration af H5 finde sted fra hydroxylgruppen til S1-atomet via stw-ts2 sammen med bruddet på S1-C2-bindingen, hvilket i sidste ende vil føre til produkterne.

Figur 1

De samordnede og trinvise veje for arylamin N-acetyltransferaser katalyseret reaktion.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 2

Strukturen af overgangstilstande for både den samordnede og trinvise vej for PABA.

Resultaterne viser, at alle overgangstilstandene er karakteriseret ved en fireleddet ringstruktur, som er næsten planar. Der er to små vinkler mindre end 80° i hver overgangstilstand (C2S1H5 og S1C2N4 for con-ts, C2O3H5 og C2N4H5 for stp-ts1, C2S1H5 og S1C2O3 for stp-ts2), hvilket medfører stor belastning for hele systemet og gør det ustabilt. Blandt de seks samordnede overgangstilstande (con-ts) for alle substraterne er egenskaberne for bindingen C2N4, N4H5 og S1H5 nogenlunde de samme for alle substraterne, mens interaktionen mellem S1 og C2 er en af de afgørende faktorer for det samordnede trin.

Tingene bliver anderledes for de trinvise veje. Hybridiseringsændringerne af C2-atomet følger en lignende tendens (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) for alle substraterne under den trinvise acetylering (Tabel 1 supplementær). Den første migration af H5 vil føre til overgangstilstand stp-ts1, og derefter er et mellemprodukt ved navn intmed placeret på den potentielle energioverflade (PES), som er et lokalt minimum. Det er et tetraedrisk thiolesterintermediat som foreslået i tidligere eksperimentelle undersøgelser . Det er kortvarigt, og en efterfølgende H5-overførsel vil snart finde sted via overgangstilstand stp-ts2. For den trinvise vej adskiller strukturerne af overgangstilstandene for forskellige substrater sig kun meget lidt fra andre. 3D-strukturerne af overgangstilstandene blev opført for PABA (figur 2), de andre lignede dem.

3.3. Energierne

De relative energier for alle mulige veje for de seks substrater er udført på grundlag af energisummen af reaktanterne taget som nul (figur 3). Af figur 3 fremgår det, at de samordnede veje foretrækkes frem for de trinvise veje. Energibarriererne for de samordnede overgangstilstande (con-ts) er lavere end for de trinvise (stp-ts1) i et interval på 83,5 kJ/mol til 26,9 kJ/mol (tabel 2 i tillæg). Arylhydrazinerne er bedre substrater end arylaminerne, og HDZ er det mest reaktive med den laveste aktiveringsenergi, hvilket svarer til de eksperimentelle data med god overensstemmelse . Denne konklusion kunne også drages af analysen af strukturdataene (tabel 1, tillægstabel 1). Den øgede konjunktionseffekt og delokaliseringen af nitrogen lone parrene ved rygsøjlen stabiliserede overgangstilstanden. Bioaktiviteten for alle substraterne øges i en sekvens af PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.

Figur 3

Energiprofilerne for alle substrater.

4. Konklusioner

Der kan drages følgende konklusioner.

(i)Alle substrater kan acetyleres via to forskellige veje: den samordnede og den trinvise, og førstnævnte er meget foretrukket på grund af de lavere aktiveringsenergier.(ii)Ud fra vores beregning er arylhydraziner bedre substrater end arylaminerne, og HDZ er det mest reaktive med den laveste aktiveringsenergi. Bioaktiviteten for alle substraterne øges i en sekvens som PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, hvilket stemmer meget godt overens med de eksperimentelle resultater . (iii)Konjunktionseffekten og de delokaliserede lone par spiller meget vigtige roller i acetylering. Den forstærkede konjunktionseffekt og det stigende antal af de ensomme par ved den seks-ledede ring vil føre til den lavere energibarriere.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af National Natural Scientific Foundation of China (no.2060303030, no.20873074, og no.10674114), 973-projektet fra Kinas ministerium for videnskab og teknologi (nr. 2009CB930103), Natural Scientific Foundation of Shandong Province (nr. Q2008B07) og Foundation for Creative Research Groups of Ludong University (nr. 08-CXA001).

Supplementerende materialer