Abstracto
En este trabajo se investigan con la teoría del funcional de la densidad los mecanismos de acetilación de varios sustratos típicos seleccionados a partir de experimentos, incluyendo arilaminas y arilhidrazinas. Los resultados indican que todos los estados de transición se caracterizan por una estructura de anillo de cuatro miembros, y la hidralazina (HDZ) es el sustrato más potente. La bioactividad de todos los compuestos aumenta en una secuencia de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. El efecto de conjunción y la deslocalización de los pares solitarios del átomo de N juegan un papel clave en la reacción. Todos los resultados son consistentes con los datos experimentales.
1. Introducción
Las N-acetiltransferasas de arilamina (NATs, EC 2.3.1.5) son enzimas del metabolismo de fase II que se encuentran tanto en procariotas como en eucariotas . La reacción de N-acetilación conduce a la desintoxicación de xenobióticos de arilamina y, finalmente, dirige a los iones de arilnitrenio electrófilos, que se consideran responsables de la formación de aductos de ADN . Para los humanos, las dos isozimas NAT funcionales, NAT1 y NAT2, muestran grandes diferencias en la especificidad del sustrato y en la distribución tisular a pesar del 81% de identidad de la secuencia de aminoácidos . La última, NAT2, se expresa predominantemente en el hígado y el epitelio intestinal. Estudios anteriores han supuesto que las NATs catalizan una transferencia de acetilo mediante un mecanismo cinético clásico de ping-pong (Esquema 1). El análisis de mutagénesis dirigida al sitio del NAT2 humano y del NAT de Salmonella typhimurium (StNAT) sugirió que un residuo de cisteína en el sitio activo era responsable de mediar el proceso de acetilación. Un reciente estudio cinético en estado pre-determinado y en estado estacionario sobre el acetato de p-nitrofenilo (PNPA) y NAT2 reveló que el mecanismo catalítico de NAT2 podría depender de la formación de un par tiolato-imidazolio. Aunque la enzima se encuentra tanto en eucariotas como en procariotas, las funciones endógenas de los NAT todavía no están claras. La determinación del sustrato reveló que tanto las arilaminas como las arilhidrazinas podían ser acetiladas por las NATs . Los pasos requeridos en la reacción de transferencia de acetilo se componen de la transferencia del grupo acetilo desde el residuo de cisteína del sitio activo al sustrato, y la eliminación de un protón de este último al primero. En este trabajo, se dispone de un estudio teórico detallado sobre los comportamientos de los sustratos arilaminas y arilhidrazinas en la acetilación, incluyendo las propiedades de sus estructuras, los estados de transición, los perfiles de energías.
La reacción de transferencia de acetilo catalizada por NATs.
2. Metodologías
Todos los cálculos se realizaron con el método de la teoría del funcional de la densidad (DFT) B3LYP implementado en el paquete de programas Gaussian03 , que se ha empleado previamente con éxito en una serie de sistemas enzimáticos . Cuando se utilizaron los conjuntos de bases 6-31G* y 6-311+G (3df, 2p), se prefirió el funcional híbrido B3LYP a los métodos Hartree-Fock (HF) y MP2 . Aunque a veces falla en el tratamiento de las interacciones ricas en dispersión, el método B3LYP se ha aplicado con éxito en muchos sistemas biológicos .
Las geometrías de todos los reactivos, intermedios y productos se optimizan en el nivel de teoría B3LYP/6-31G*. Se han calculado las conformaciones más estables así como sus energías en cada equilibrio y estados de transición. Se realizan cálculos de frecuencia para todos los puntos estacionarios resultantes y cada estado de transición tiene una sola frecuencia imaginaria. Además, se emplea el método MP2/6-311+G** en las estructuras optimizadas de los puntos estacionarios para obtener perfiles energéticos más precisos. Si no se indica especialmente, todos los análisis energéticos siguientes se refieren a los resultados de los cálculos MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d).
3. Resultados y discusión
3.1. Los sustratos de frontera
Se seleccionan seis sustratos, el ácido p-aminobenzoico (PABA), la 4-metoxilanilina (4-MA), el 4-aminosalicilato (4-AS), el 5-aminosalicilato (5-AS), la isoniazida (INZ) y la hidralazina (HDZ), según las referencias, que pueden dividirse en dos familias distintas: las arilaminas y las arilhidrazinas. En la Tabla 1 se enumeran las energías de los obitales de frontera (incluyendo HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 y LUMO+2) de los seis sustratos, que se considera que desempeñan papeles importantes en los sistemas bioenzimáticos . Para las arilaminas, las energías HOMO se reducen en una secuencia de 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, lo que indica el aumento de su reactividad nucleofílica. Entre los seis sustratos (véase la Figura 1 en los materiales suplementarios disponibles en línea en doi: 10.1155/2009/783035), INZ tiene la mayor brecha energética entre HOMO y LUMO, lo que sugiere su estabilidad. Los resultados del Análisis de la Población Natural (NPA) mostraron que los átomos de amino activo de la familia de las arilaminas son más electronegativos que los del grupo de las hidracinas, lo que se debe principalmente al efecto de conjugación.
Aunque el PABA y el 4-AS tienen diferentes sustituciones en el sitio p del grupo amino en el anillo de seis miembros, sus bioactividades son casi las mismas. Un enlace H intermolecular estabilizará el propio sustrato con una caída de energía de unos 19-21 kJ/mol. Tanto las energías HOMO como LOMO para el 5-AS son mayores que las del 4-A𝑆s, lo que sugiere que el primero es más reactivo que el segundo.
En el caso de los sustratos de arilhidrazinas, el par solitario de los átomos de N en la espina dorsal del anillo de seis miembros se deslocaliza en todo el sistema para aumentar su estabilidad. Los valores 𝐸(𝐿-𝐻)de la HDZ son 0,0318 u.a. más altos que los de la INZ, lo que indica su mayor reactividad que esta última.
3.2. Las diferentes vías y estados de transición
En principio, todos los sustratos pueden reaccionar con el residuo de cisteína del sitio activo a través de una vía concertada o una vía escalonada. En la primera, los estados de transición (véanse las figuras 1 y 2, con-ts) experimentan una transferencia concertada del hidrógeno H5 al átomo S1 de la cisteína y una formación de enlaces entre los átomos N4 y C2. La ruptura de los enlaces antiguos (N4H5 y S1C2) y la formación de los nuevos (C2N4 y S1H5) tienen lugar simultáneamente. Los reactivos y los productos objetivo están conectados por el único estado de transición en la superficie de energía potencial (PES). Los datos de la estructura principal de todos los estados de transición se enumeran en la Tabla 1 de los materiales suplementarios. Para el mecanismo escalonado, el átomo H5 se transfiere en primer lugar al átomo O3 del grupo carbonilo, tendiendo a generar un nuevo enlace entre el átomo N4 y el C2 a través del estado de transición stw-ts1. Entonces, se formará un intermedio de tioléster (intmed). En consecuencia, se producirá la segunda migración de H5 desde el grupo hidroxilo al átomo S1 vía stw-ts2 junto con la ruptura del enlace S1-C2, que finalmente dirigirá a los productos.
Las vías concertadas y escalonadas de la reacción catalizada por las N-acetiltransferasas de arilamina.
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La estructura de los estados de transición para la vía concertada y escalonada del PABA.
Los resultados indican que todos los estados de transición se caracterizan por una estructura de anillo de cuatro miembros que es casi plana. Hay dos pequeños ángulos menores de 80° en cada estado de transición (C2S1H5 y S1C2N4 para los con-ts, C2O3H5 y C2N4H5 para los stp-ts1, C2S1H5 y S1C2O3 para los stp-ts2), que aportan una gran tensión a todo el sistema y lo hacen inestable. Entre los seis estados de transición concertados (con-ts) de todos los sustratos, las propiedades del enlace C2N4, N4H5 y S1H5 son aproximadamente las mismas para todos los sustratos, mientras que la interacción entre S1 y C2 es uno de los factores determinantes para el paso concertado.
Las cosas se vuelven diferentes para las vías escalonadas. Los cambios de hibridación del átomo C2 siguen una tendencia similar (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) para todos los sustratos durante la acetilación por pasos (Tabla 1 suplementaria). La primera migración de H5 conducirá al estado de transición stp-ts1, y entonces se localiza un intermedio llamado intmed en la superficie de energía potencial (PES), que es un mínimo local. Se trata de un intermedio tetraédrico de tioléster, tal y como se ha propuesto en estudios experimentales anteriores. Es de corta duración y pronto se producirá la consiguiente transferencia de H5 a través del estado de transición stp-ts2. Para la vía escalonada, las estructuras de los estados de tracción para diferentes sustratos difieren muy poco con otras. Las estructuras 3D de los estados de transición fueron listadas para el PABA (Figura 2), las otras fueron similares a aquellas.
3.3. Las energías
Las energías relativas de todas las vías posibles para los seis sustratos se llevan a cabo en base a la suma de energía de los reactivos tomada como cero (Figura 3). A partir de la Figura 3, encontramos que las vías concertadas se ven favorecidas frente a las escalonadas. Las barreras energéticas de los estados de transición concertados (con-ts) son menores que las de los escalonados (stp-ts1) en un rango de 83,5 kJ/mol a 26,9 kJ/mol (Tabla 2 suplementaria). Las arilhidrazinas son mejores sustratos que las arilaminas, y la HDZ es la más reactiva con la menor energía de activación, lo que coincide con los datos experimentales. Esta conclusión también puede extraerse del análisis de los datos de estructura (Tabla 1 suplementaria). El efecto de conjunción mejorado y la deslocalización de los pares solitarios de nitrógeno en la columna vertebral estabilizaron el estado de transición. La bioactividad para todos los sustratos aumenta en una secuencia de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
Los perfiles de energía para todos los sustratos.
4. Conclusiones
Se pueden extraer las siguientes conclusiones.
(i)Todos los sustratos pueden ser acetilados a través de dos vías diferentes: la concertada y la escalonada, y se prefiere la primera debido a las menores energías de activación.(ii)Según nuestros cálculos, las arilhidrazinas son mejores sustratos que las arilaminas, y la HDZ es la más reactiva y con menor energía de activación. La bioactividad para todos los sustratos se incrementa en una secuencia como PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, que concuerda muy bien con los resultados experimentales . (iii) El efecto de conjunción y los pares solitarios deslocalizados juegan un papel muy importante en la acetilación. El efecto de conjunción mejorado y el número creciente de los pares solitarios en el anillo de seis miembros conducirá a la barrera de energía más baja.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Científica Nacional Natural de China (no.20603030, no.20873074, y no.10674114), el proyecto 973 del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (nº 2009CB930103), la Fundación Científica Natural de la Provincia de Shandong (nº Q2008B07) y la Fundación para Grupos de Investigación Creativa de la Universidad de Ludong (nº 08-CXA001).
Materiales suplementarios
Por la limitación de longitud de este trabajo, las estructuras 3D de todas las arilaminas, y sustratos de arilhidrazinas, los datos de la estructura principal para todos los estados de transición y las energías relativas para diferentes vías se reunieron en los materiales suplementarios.
- Materiales suplementarios