Olet lentokentällä kuluttamassa aikaa, kun sinulla on huomenna aamulla raportti professoriisi. Sinulla on datasi. Mikset hyödyntäisi aikaa ja laskisi viime viikolla tekemässäsi ensimmäisessä qPCR-kokeessa testaamiesi geenien ekspression kertaistunutta muutosta?
Se on helppoa – näytän sinulle, miten.
Tarkista menetelmäsi
On olemassa kaksi tärkeintä tapaa analysoida qPCR-dataa: kaksinkertainen delta-Ct-analyysi ja suhteellinen standardikäyrämenetelmä (Pfaffl-menetelmä). Molemmat menetelmät tekevät oletuksia ja niillä on rajoituksensa, joten analyysiin käytettävä menetelmä riippuu koesuunnitelmastasi.
Tupla delta Ct -analyysissä oletetaan, että:
- alukesarjojen välillä on yhtä suuri alukkeiden tehokkuus (ts. 5 %:n sisällä);
- referenssi- ja kohdegeenien amplifikaatiotehokkuus on lähes 100 %;
- sisäiset kontrolligeenit ekspressoituvat jatkuvasti eikä käsittely vaikuta niihin.
Menetelmä soveltuu yleensä kokeisiin, joissa on suuri määrä DNA-näytteitä ja pieni määrä testattavia geenejä.
Suhteellinen standardikäyrämenetelmä olettaa, että:
- kontrollinäytteiden ja käsiteltyjen näytteiden välillä on yhtä suuri tehokkuus.
Tämä menetelmä toimii paremmin, jos DNA-näytteitä on vähemmän mutta testattavien geenien määrä on suurempi.
Mitä tarvitset kaksoisdeltan Ct-analyysiin
- qPCR:n Ct-arvot (raakadata):
- kotihoitogeeni: kontrolli- ja koeolosuhteet;
- kiinnostuksen kohteena oleva geeni: kontrolli- ja koeolosuhteet;
- Excel-taulukkolaskentaohjelma.
Ja siinä kaikki! Kalliita ohjelmistoja ei tarvita.
Tässä on nopea yhteenveto kaksinkertaisen delta-Ct-analyysin tärkeimmistä vaiheista (yksityiskohtaisen selityksen saat lukemalla tämän artikkelin).
4 askelta kaksinkertaiseen delta-Ct-analyysiin
1. Ota keskiarvo housekeeping-geenin ja testattavan geenin Ct-arvoista koe- ja kontrolliolosuhteissa, jolloin saat 4 arvoa. Nämä neljä arvoa ovat testattava geeni Kokeellinen (TE), testattava geeni Kontrolli (TC), taltiointigeeni Kokeellinen (HE) ja taltiointigeeni Kontrolli (HC). (Koe)
2. Laske koearvojen (TE – HE) ja kontrolliarvojen (TC – HC) erot. Nämä ovat \DeltaCt-arvot kokeellisille olosuhteille (\DeltaCTE) ja kontrolliolosuhteille (\DeltaCTC).
3. Laske sitten kokeellisten ja kontrolliolosuhteiden \DeltaCt-arvojen erotus (\DeltaCTE – \DeltaCTC) saadaksesi kaksinkertaisen deltaCt-arvon (ddCt).
4. Koska kaikki laskutoimitukset tehdään logaritmiperustassa 2, aina kun DNA:ta on kaksi kertaa enemmän, Ct-arvot pienenevät 1:llä eivätkä puolitu. Sinun on laskettava arvo 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} saadaksesi ilmaisun fold change.
| dCt-arvo (koe) | dCt-arvo (kontrolli) | ddCt-arvo | Expression taittomuutos |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0.33 | 0.70 | 0.615572207 |
Mitä arvo tarkoittaa?
Nyt kun sinulla on arvosi taitekerroksen muutokselle, mitä se oikeastaan tarkoittaa? Tämä arvo on kiinnostavan geenisi kertaistunut muutos testiolosuhteissa suhteessa kontrolliolosuhteisiin, jotka kaikki on normalisoitu talousgeeniin.
Tehdäksesi asian hieman selkeämmäksi – voit ajatella sitä prosentteina. Kertainen muutos 1 tarkoittaa, että geeniekspressiota on 100 % yhtä paljon testiolosuhteessa kuin kontrolliolosuhteessa – eli koeryhmän ja kontrolliryhmän välillä ei ole muutosta. Yli 1-kertainen muutosarvo osoittaa, että kiinnostuksen kohteena oleva geeni on kohonnut suhteessa kontrolliin (1,2-kertainen muutos = 120 % geeniekspressiosta suhteessa kontrolliin, 5 = 500 %, 10 = 1000 % jne.). Alle 1:n arvot osoittavat geenin alaregulaatiota suhteessa kontrolliin (0,5-kertainen muutos on 50 % geenin ilmentymistä suhteessa kontrolliin, eli puolet vähemmän ilmentymistä kuin kontrollissa jne.).
Voit esittää nämä tiedot fold-change-pylväsdiagrammeina siten, että kontrolliolosuhteiden kuvaaja on yhtä suuri kuin 1. Voit myös käyttää tilastollisia analyysejä muutosten merkitsevyyden tarkistamiseksi, esim. käyttämällä varianssianalyysiä (ANOVA) tai t-testejä, mikä tahansa sopii koeasetelmaasi!
Käyttämällä näitä vaiheita voit suorittaa qPCR-analyysin missä tahansa oletkin, vaikka olisitkin matkalla. Helpottaaksesi asioita entisestään voit luoda Excel-mallin, jota voit käyttää joka kerta. Sitten sinun tarvitsee vain syöttää tietosi ja hämmästytät muita nopeudellasi analyysien suorittamisessa!
Originally published July 9, 2016. Tarkistettu ja päivitetty 8. helmikuuta 2021.
Lisälukemista
Livak KJ, Schmittgen TD. Suhteellisten geeniekspressiotietojen analysointi käyttäen reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää ja 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} Method. Methods. 2001;25:402-8.
Onko tästä ollut apua? Jaa sitten verkostollesi.