Tulokset
CAMP:n kuvantaminen elävien solujen primaarisissa värekarvoissa fluoresoivien biosensoreiden avulla tuo mukanaan useita ainutlaatuisia haasteita. Ensinnäkin säikeet ovat pieniä ja hoikkia, jotka työntyvät 2-10 µm solun pinnan yläpuolelle; toiseksi, vaikka ne eivät liiku, ne joutuvat liikkumaan uimaliuoksessa tapahtuvan irtovirtauksen vuoksi, ja kolmanneksi, vilpittömiä säikesignaaleja voi olla vaikea erottaa optisesti solurungosta peräisin olevasta taustafluoresenssista. Aiemmin on kuvattu useita ciliumiin kohdistettuja cAMP-reporttereita (19, 24, 25), mutta me pyrimme luomaan ratiometrisiä biosensoreita, joiden kirkkaus ja kohdistustarkkuus ovat paremmat. Kun olimme testanneet lukuisia malleja, havaitsimme, että parhaan kohdentuvuuden, kirkkauden ja herkkyyden tarjoavat Kees Jalinkin laboratoriosta peräisin olevat neljännen sukupolven Epac-pohjaiset koettimet (EpacH188 ja korkeamman affiniteetin versio EpacH187) (26) yhdistettynä Arl13b:hen, proteiiniin, joka on lokalisoitunut vahvasti värekarvoihin (27) (kuva 1A). Anturit, jotka sisälsivät 5-HT6-reseptorin, antoivat verrattain hyvän lokalisoinnin kuin Arl13b:hen kytketyt koettimet; kuten jäljempänä käsitellään, 5-HT6-reseptorit, jotka eivät ole lokalisoituneet värekarvoihin, aiheuttivat kuitenkin solujen cAMP:n kohoamisen tämän GPCR:n tunnetun konstitutiivisen aktiivisuuden vuoksi (28).
cAMP-signalointi digitoniini-permeabiloitujen solujen värekarvoissa. Kaikki kokeet suoritettiin solunsisäisessä kaltaisessa puskurissa, jota täydennettiin ATP:llä ja GTP:llä. (A) 5-HT6-mCherryä ja Arl13b-H187:ää ilmentävät mIMCD3-solut, jotka on lokalisoitu sekä soluun että ciliumiin, eivät reagoineet 10 µM 5-HT:hen solurungossa tai ciliumissa 2 minuutin käsittelyn jälkeen 20 μg/mL digitoniinilla (4 koetta, 5 cilia). (B) Vastaavasti reagointikyky käänteisagonistiin 1 µM SB742457 ja sitä seuraava 5-HT6 rebound -vaste katosivat sekä solussa että ciliumissa 2 minuutin käsittelyn jälkeen 20 μg/mL digitoniinilla (3 koetta, 3 cilia). (C) Digitoninin permeabilointi poisti 50 µM:n forskoliinin indusoiman cAMP-signaalin soluelimissä, mutta cAMP-lisäys oli havaittavissa värekarvoissa. 1 mM IBMX:n indusoima PDE:n esto ei paljastanut mitään signaalia (n = 4 koetta, joissa oli 4 värekarvaa/7 solua). (D) AC3-kotransfektio ei muuttanut forskoliinivastetta. (E) Kvantifiointi ja vertailu cAMP-vasteesta forskoliinille soluelimissä ja värekarvoissa; **P = 0,0002, ***P = 00019. Siniset jäljet = solurunko, punaiset jäljet = säikeet. Aikapalkit: 3 min. Y-akseli on 480/535 nm:n suhde.
Näönmukainen selitys vaikutuksen puuttumiselle edellisissä kokeissa oli se, että cAMP ei kertynyt riittävästi, jotta reportteri olisi voinut tarttua siihen. Kun sama koe kuitenkin toistettiin käyttämällä forskoliinia, jolla aktivoitiin suoraan sisäsyntyisiä AC:itä (adenylyylisyklaaseja), jotka ovat läsnä sädekehän kalvolla, havaittiin pieni mutta johdonmukainen cAMP:n kertyminen sädekehän mikroympäristössä, mutta ei solurungossa (Kuva 4 C ja E, vasemmanpuoleiset pylväsdiagrammit). Samanlaisia tuloksia saatiin soluissa, jotka ekspressoivat AC3:a (36) (Kuva 4 D ja E, oikeanpuoleiset pylväsdiagrammit), joka lokalisoitui värekarvoihin, kun sitä ekspressoitiin mIMCD3-soluissa (SI-liite, Kuva S8). Olettaen, että permeabilointi ei johtanut GPCR-signalointikoneiston olennaisten komponenttien häviämiseen, pieni mutta havaittava muutos forskoliinin lisäämisen jälkeen viittaa siihen, että GPCR-riippuvaiset cAMP-signaalit olisi pitänyt pystyä ratkaisemaan, jos ne tapahtuisivat ciliumissa. Nämä tiedot osoittavat myös, että mIMCD3-solujen ciliumkalvo säilyi ehjänä digitoniinikäsittelyn jälkeen.
Edelliset tiedot jättävät meidät kysymään, miksi GPCR:t eivät kykene tuottamaan cAMP:ia sen jälkeen, kun ne on eristetty ciliumiin. Aikaisemmissa tutkimuksissa on mainittu Ca2+:n pääsy sädekehän kalvon läpi tärkeänä organellien cAMP:n säätelijänä, mikä johtuu sädekehäspesifisten Ca2+:aa johtavien kanavien (PKD2L1 ja PKD2) ja Ca2+:n säätelemien AC:ien (AC1, 8, 5 ja 6) läsnäolosta (11, 16, 23, 32, 37). MIMCD3-solujen primaaristen värekarvojen on raportoitu sisältävän Ca2+:aa estäviä AC5- ja/tai AC6-kanavia (10). Siksi katsoimme, että ciliumin korkea lepo- ja Ca2+-läpäisevyys (38, 39) voisi selittää 5-HT6-reseptoriin kytkeytyneiden AC:ien inaktivoitumisen. Parantaaksemme tätä asiaa paremmin paransimme anturia korvaamalla Arl13b-kohdistussekvenssin toiminnallisella 5-HT6-reseptorilla, jotta cAMP-reportteri-GPCR-fuusio voidaan kohdistaa suoraan ciliumiin (5-HT6-EpacH187). Kuvien 3I ja 4C tietojen mukaisesti 5-HT ei tuottanut mitattavaa cAMP-signaalia, kun se kohdistettiin yksinomaan ciliumiin (kuva 5A). Solujen altistaminen nimellisesti Ca2+ -vapaille liuoksille ei pelastanut 5-HT-vastetta värekarvoissa (kuva 5B), mikä osoittaa, että Ca2+:n pääsy värekarvojen kalvon läpi ei tukahduttanut signaalia. Harkitsimme, että ehkä 5-HT6:n ilmentyminen muutti Gαs-proteiinin siiliajakaumaa mIMCD3-soluissa, mutta immunovärjäyskokeet viittasivat siihen, että näin ei ole (SI-liite, kuva S9). Kun testasimme kuitenkin 5-HT:n vaikutusta soluissa, joita oli esikäsitelty SAG:lla (250 nM – 1 µM) Smo-reseptorien aktivoimiseksi (40), pystyimme palauttamaan 5-HT6-reseptorin reagointikyvyn agonistille (kuva 5C). Herkkyys käänteiselle agonistille oli myös ilmeinen, mikä viittaa konstitutiivisen aktiivisuuden palautumiseen (kuva 5D).
Hedgehog-reitin aktivointi lisää 5-HT6-Epac-H187:n ilmoittamaa cAMP-vastetta 5-HT:lle ja dopamiinille primaarisissa värekarvoissa: (A) Yhdenmukaisesti kuvien 3I ja 4C tietojen kanssa mIMCD3-solut eivät vastanneet 10 µM 5-HT:hen, kun anturi/reseptori-fuusio oli rajoitettu tiukasti sädekehän kalvoon (6 koetta, 6 sädekehää). (B) Korkean vaimentaminen värekarvoissa sijoittamalla solut nimellisesti Ca2+ -vapaaseen liuokseen ei pelastanut 5-HT:n stimuloimaa cAMP-signalointia (5 koetta, 6 värekarvaa). (C) Yön yli tapahtuneen esikäsittelyn jälkeen 1 µM SAG:lla 5 cilia 6:sta (6 koetta) reagoi 5-HT-stimulaatioon (**P = 0,000992). (D) Esikäsittely 1 µM SAG:lla pelasti vasteen 1 µM SB742257:lle (-35,5 ± 11,2 % lähtötason alapuolella suhteessa seuraavaan 10 µM 5-HT:n aikaansaamaan cAMP-lisäykseen; tyypillistä 4 kokeelle, 4 cilia). (E) 10 μM 5-HT:n aiheuttama cAMP-lisäys NIH 3T3:n piilevissä (tyypillinen 9 kokeesta, 11 piilevää). (F) Yön yli tapahtuva esikäsittely 1 μM SAG:lla lisäsi merkittävästi 5-HT-vastetta (**P = 0,00034; 6 koetta, 7 cilia). Yön yli tapahtuvalla esikäsittelyllä 10 μM syklopamiinilla (Cyclo) oli vähäinen vaikutus (8 koetta, 9 cilia, pylväsdiagrammi). (G ja H) 100 nM somatostatiini (SST) heikensi 5-HT-vastetta SSTR3-GFP:tä sisältävissä piilevissä SAG-esikäsittelyllä ja ilman sitä (G: 5 koetta, 6 piilevää; H: 2 koetta, 5 piilevää). (I ja J) SAG-esikäsittely lisäsi 10 nM dopamiinin (DA) vastetta (I: 4 koetta, 4 cilia, J: 4 koetta, 6 cilia, **P = 0.002476). Siniset jäljet, solurunko; punaiset jäljet, säikeet. Aikapalkit: 3 min. Y-akseli on 480/535 nm:n FRET-suhde. Palkkikaaviot osoittavat 5-HT- tai DA-vasteen prosentteina forskoliini/IBMX-vasteesta; virhepalkit edustavat SEM.
Edelliset tulokset jättivät meidät kysymään, oliko mIMCD3-soluissa ilmentyvän 5-HT6-reseptorin odottamaton SAG-riippuvainen ylössäätely solutyyppi- ja/tai GPCR-spesifinen. Toisin kuin mIMCD3, 3T3-solujen (kuva 5E) ja MEF-solujen (SI-liite, kuva S10A) stimulointi 5-HT:llä tuotti mitattavissa olevan suhdeluvun muutoksen, joka kuitenkin vahvistui merkittävästi SAG-käsittelyn jälkeen (kuva 5F ja SI-liite, kuva S10B). Mielenkiintoista on, että sileän reseptorin antagonisti syklopamiini, jonka voisi olettaa vaikuttavan päinvastoin kuin SAG, ei poistanut 5-HT-stimuloitua cAMP-signaalia 3T3-solujen primaarisissa värekarvoissa (pylväsdiagrammi, Kuva 5F).
Käyttämällä tätä järjestelmää pystyimme myös arvioimaan värekarvojen Gαi-liitännäisen GPCR:n, SSTR3:n, kykyä käänteistää serotoniinistimuloituja cAMP-signaaleja värekarvoissa. SSTR3-GFP:tä ja 5-HT6-H187:ää yhdessä ilmentävien 3T3-solujen käsittely somatostatiinilla käänsi 5-HT-vasteet takaisin lähtötasolle 2 minuutin kuluessa SAG-käsittelyn läsnä ollessa ja sen puuttuessa (Kuva 5 G ja H), mikä osoittaa 5-HT6-toiminnon paikallista kontrollia. Tämän jälkeen testasimme edelleen, miten SAG vaikutti toisen sädekehän Gαs-kytketyn GPCR:n, dopamiini D1R-reseptorin (5), toimintaan. D1R-EGFP:tä ekspressoitiin yhdessä 5-HT6-H187:n kanssa 3T3-soluissa, ja valittiin solut, joissa fluoresenssi esiintyi vain värekarvoissa. Kymmenen nanomolaarinen dopamiini tuotti pieniä mutta mitattavissa olevia cAMP-signaaleja kontrollisoluissa (kuva 5I), ja jälleen signaali voimistui merkittävästi SAG-käsittelyn jälkeen (kuva 5J; yhteenveto pylväsdiagrammissa).