Todelliset istukkaiset nisäkkäät (kruunuryhmä, johon kuuluvat kaikki nykyiset istukkaiset) ovat syntyneet Eutheria-klaadin kantaryhmän jäsenistä, joita oli ollut olemassa ainakin keskimmäiseltä jurakaudelta, noin 170 MYA:sta lähtien. Nämä varhaiset eutherialaiset olivat pieniä, yöaktiivisia hyönteissyöjiä, joilla oli sopeutumia puissa elämiseen.
Todelliset istukkaat ovat saattaneet syntyä myöhäiskaudella noin 90 MYA, mutta varhaisimmat kiistattomat fossiilit ovat varhaiselta paleoseenikaudelta, 66 MYA, liitukauden ja paleogeenin välisen sukupuuttotapahtuman jälkeen. Protungulatum donnae -lajia pidettiin varsi-keuhkoeläimenä, joka tunnetaan metrin verran liitukauden ja paleogeenin välisen rajan yläpuolella geologisessa kerrostumassa, joka merkitsee liitukauden ja paleogeenin välistä sukupuuttotapahtumaa, ja Purgatorius -lajia, jota aiemmin pidettiin varsi-keuhkoeläimenä, esiintyy korkeintaan 300 000 vuotta K-Pg-kuolleisuus- ja paleogeenin välisen rajan jälkeen; kumpaakin lajia pidetään nykyään kuitenkin ei-paikkatietoisina eutereina. Istukkaisten nopea ilmaantuminen liitukauden lopulla tapahtuneen joukkosukupuuton jälkeen viittaa siihen, että ryhmä oli saanut alkunsa ja käynyt läpi ensimmäisen diversifikaationsa jo myöhäisliitukaudella, kuten molekyylikellot osoittavat. Xenarthraan ja Afrotheriaan johtavat sukulinjat syntyivät luultavasti noin 90 MYA, ja Boreoeutheria koki ensimmäisen diversifikaation noin 70-80 MYA, mikä tuotti sukulinjat, jotka lopulta johtivat nykyaikaisiin kädellisiin, jyrsijöihin, hyönteissyöjiin, niveljalkaisiin ja lihansyöjiin.
Nykyaikaiset istukaslajien järjestyksen jäsenet ovat kuitenkin syntyneet paleogeenin aikana noin 66-23 MYA liitukauden ja paleogeenin välisenä aikana tapahtuneen sukupuuton jälkeen. Nykyaikaisten kädellisten, jyrsijöiden ja lihansyöjien kaltaisten kruunueläinluokkien evoluutio näyttää olevan osa sopeutumissäteilyä, joka tapahtui, kun nisäkkäät kehittyivät nopeasti hyödyntämään ekologisia markkinarakoja, jotka jäivät avoimiksi, kun suurin osa dinosauruksista ja muista eläimistä katosi Chicxulubin asteroiditörmäyksen jälkeen. Uusia markkinarakoja valloittaessaan nisäkkäiden ruumiinkoko kasvoi nopeasti, ja ne alkoivat vallata suurten kasvinsyöjien ja suurten lihansyöjien markkinarakoja, jotka olivat jääneet avoimiksi dinosaurusten hävitessä. Nisäkkäät hyödynsivät myös markkinarakoja, joihin dinosaurukset eivät olleet koskaan koskeneet: esimerkiksi lepakot kehittyivät lentämään ja kaikuluotainten avulla, minkä ansiosta ne pystyivät olemaan erittäin tehokkaita yöllisiä, ilmassa liikkuvia hyönteissyöjiä, ja valaat valloittivat ensin makeanveden järviä ja jokia ja siirtyivät sitten valtameriin. Kädelliset puolestaan hankkivat erikoistuneet tartuntakädet ja -jalat, joiden avulla ne pystyivät tarttumaan oksiin, sekä suuret silmät ja tarkemman näkökyvyn, joiden avulla ne pystyivät etsimään ravintoa pimeässä.
Maalla elävien istukkaiden evoluutio kulki eri mantereilla eri reittejä, koska ne eivät pysty helposti ylittämään suuria vesistöjä. Poikkeuksena ovat pienemmät istukkaat, kuten jyrsijät ja kädelliset, jotka lähtivät Laurasiasta ja asuttivat Afrikan ja sen jälkeen Etelä-Amerikan koskenlaskun kautta.
Afrikassa Afrotheria kävi läpi suuren sopeutumissäteilyn, joka johti elefantteihin, elefanttikäärmeisiin, tenrekkeihin, kultamyyräkoiriin, aardvarkeihin ja manaatteihin. Etelä-Amerikassa tapahtui samankaltainen tapahtuma, Xenarthra-suvun säteily, joka johti nykyaikaisiin laiskiaisiin, muurahaiskarhuihin ja vyötiäisiin sekä sukupuuttoon kuolleisiin maaoraviin ja glyptodontteihin. Laurasiassa levittäytymistä hallitsi Boreoeutheria, johon kuuluvat kädelliset ja jyrsijät, hyönteissyöjät, lihansyöjät, perissodaktyylit ja artiodaktyylit. Nämä ryhmät laajenivat yhden mantereen ulkopuolelle, kun muodostui maasiltoja, jotka yhdistivät Afrikan Euraasiaan ja Etelä-Amerikan Pohjois-Amerikkaan.