Tulokset ja keskustelu
Spirogyran konjugoitumisen on raportoitu indusoituvan typpipitoisuuden alentamisella tai typen vähentämisellä (Grote 1977; Yamashita ja Sasaki 1979; Simons ym. 1984). Siksi yritimme ensin indusoida konjugaatiota vähentämällä typpeä elatusaineesta. Tämä ei kuitenkaan onnistunut. Grote (1977) raportoi, että konjugaatio indusoitui puhtaassa epäorgaanisessa klosteriympäristössä ja että pH-arvo oli tärkeä. Vaikka inkuboimme leväsäikeitä eri pH:n väliaineessa, konjugaatiota ei saatu aikaan. Lisäksi muut kokeet, eri lämpötilat ja eri ravinteiden vähentäminen, eivät tuottaneet tulosta. On raportoitu, että konjugaatio saatiin aikaan inkuboimalla leväsäikeet jatkuvassa valaistuksessa joillakin Spirogyra-lajeilla (Yamashita ja Sasaki 1979). Aineistossamme ei kuitenkaan ilmennyt konjugaatiota, vaikka filamentteja inkuboitiin ilman typpilähdettä jatkuvassa valaistuksessa kahden viikon ajan. Edellä mainittujen eri kokeilujen jälkeen onnistuimme lopulta saamaan aikaan konjugaation inkuboimalla filamentteja APW:llä valmistetulla agarlevyllä 23 °C:ssa 12:12 tunnin L-D-syklissä 4 päivän ajan. Sauvamaisia juurakoita muodostui myös päätesolujen distaaliseen päähän inkuboinnin aikana. Kun agarilevyllä olevia filamentteja inkuboitiin pimeässä, konjugaatioilmiötä ei saatu aikaan. Allen (1958) on raportoinut, että konjugaatio indusoitui inkuboimalla agarlevyllä. Hän piti kantaviljelmää käyttäen Pringsheimin maa-vesialustaa (Pringsheim 1946) 16 tunnin valo- (kylmänvalkoinen loisteputki) ja 8 tunnin pimeäaikajärjestelmässä noin 20 °C:ssa. Parittelun indusoimiseksi useita filamentteja siirrettiin 1,5-prosenttiselle Difco-agarille, joka oli valmistettu tislatusta vedestä, ja inkuboitiin noin 20 °C:ssa 16:8 h L-D-syklissä. Muutaman päivän inkuboinnin jälkeen agarilevylle muodostui zygosporeja. Vaikka valo-olosuhteet ja lämpötila inkuboinnin aikana olivat erilaiset, Allenin menetelmä (1958) oli periaatteessa sama kuin meidän menetelmämme. Analysoimme edelleen tekijöitä, jotka olivat vastuussa konjugaation induktiosta agarilevyllä, seuraavasti.
Pohdimme, oliko jokin tuntematon agarjauheen sisältämä kontaminaatio(t) vastuussa konjugaation induktiosta. Tutkimme tätä mahdollisuutta seuraavalla kokeella. Agarjauhe (Wako, Osaka, Japani) suspendoitiin APW:hen ja pidettiin 4 °C:ssa sekoittaen yön yli. Sentrifugoinnin (185 × g, 10 min) jälkeen saatu pelletti pestiin 2 kertaa APW:llä sentrifugoimalla. Lopullinen agaripelletti suspendoitiin tuoreeseen APW:hen ja levyt valmistettiin. Konjugaatio indusoitiin onnistuneesti tällä agarlevyllä. Kun leväsäikeet inkuboitiin agarjauheen pesusta saadussa supernatantissa, konjugaatiota ei saatu aikaan lainkaan (tietoja ei ole esitetty). Näin ollen inkubointi agarilevyllä, mutta ei liukoinen kontaminaatio, oli vastuussa konjugaation induktiosta.
Koska APW ei sisältänyt typpipitoisia kemikaaleja, agarilevyn ei pitäisi sisältää typpeä lainkaan tai hyvin vähän. Siksi oli mahdollista, että molemmat tekijät, sijainti agarilevyllä ja typen vähyys, vaikuttivat synergisesti induktioon. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi inkuboimme filamentteja agarlevyllä, joka oli valmistettu käyttäen APW:tä, jota oli täydennetty 1 mM KNO3:lla. Myös tällä agarilevyllä konjugaatio indusoitui (kuva 1a), mikä osoittaa, että typen köyhtyminen ei ole vastuussa konjugaation induktiosta. Lisäksi konjugaatio indusoitui, kun filamentteja inkuboitiin agarilevyllä, joka oli valmistettu closterium-alustalla, joka sisälsi erilaisia ravinteita (kuva 1b). Nämä tulokset osoittivat yksiselitteisesti, että sijainti agarilevyllä itsessään on tekijä, joka on vastuussa konjugaation induktiosta.
KNO3:n ja closterium-alustan vaikutus konjugaation käynnistymiseen agarilevyllä. Noin 100 filamenttia inkuboitiin agarilevyillä, jotka oli valmistettu käyttäen APW:tä, APW:tä, jota oli täydennetty 1 mM KNO3:lla, tai closterium-mediaa 23 °C:ssa 12:12 h L-D-syklissä 4 päivän ajan. Kun papillaa havaittiin, arvioimme, että solu aloitti konjugaation. Tulokset esitettiin konjugaatioputken muodostamisen aloittaneiden filamenttien suhteena filamenttien kokonaismäärään. Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja tiedot esitetään keskiarvona ja keskiarvon keskivirheenä (SEM)
Konjugaation indusoitumista agarilevyllä tutkittiin toisesta lajista, S.fuluviatilisista, joka erilaistui ritsoideiksi leväsäikeiden filamenttien katkaisun yhteydessä (tietoja ei ole esitetty), kuten myös S. castanacean tapauksessa. Myös tässä lajissa konjugaatio indusoitui, kun sitä inkuboitiin APW:llä valmistetulla agarlevyllä. Tutkittiin lisäksi konjugaatiota agarilevyllä kolmella Spirogyralla, jotka eivät erottaneet juurakoita. S.ellipsospora Transeau -lajia on pidetty laboratoriossa Chara-viljelmien kontaminaattina. Kahta muuta Biwa-järvestä kerättyä Spirogyra sp. -lajia pidettiin akseeniviljelminä 6 kuukauden ajan. Kaikki kolme Spirogyraa eivät osoittaneet konjugaatiota inkuboimalla agar-levyllä.
Joidenkin Spirogyra-lajien konjugaatio indusoitui typpipitoisuuden alentamisella tai vähentämisellä (Grote 1977; Yamashita ja Sasaki 1979; Simons ym. 1984). Typpipitoisuuden lisäksi valon intensiteettiä ja/tai pH:ta oli säädeltävä S. majuscule -lajissa (Grote 1977). S. castanacealla ja S. fuluviatiliksella inkubointi agar-levyllä oli tehokasta, eikä typen poistaminen ollut tarpeen (tämä tutkimus). Toisaalta Agrawal ja Singh (2002) raportoivat, että Spirogyra sp. ei aloittanut konjugaatiota 2-10-prosenttisella agarlevyllä. Tämä oli samankaltainen kuin Spirogyra sp. -lajilla saamamme tulokset, joka ei eronnut rihmastosta. Näin ollen konjugaation induktioon tarvittavat tekijät vaihtelevat paljon Spirogyra-lajien välillä. Mietimme, onko kasvun estyminen vastuussa konjugaation indusoitumisesta agarilevyllä. Kun soluja inkuboitiin agarilevyllä, joka oli valmistettu joko APW- tai closterium-alustalla, solut lisääntyivät solunjakautumisen kautta molemmilla agarilevyillä, kun solut eivät aloittaneet konjugaatioputken papillan muodostamista. Näin ollen kasvun estyminen ei ollut konjugaation laukaiseva tekijä.
Säikeiden välisen pariutumistyypin esiintymisen tutkimiseksi S. castanacea -monoklooniviljelmälle tehtiin konjugaation indusointi. 48 tunnin inkubaation jälkeen samassa filamentissa havaittiin kaksi konjugaatiotyyppiä (kuva 2a-c). Kuvassa 2b näkyy solujen indusoima skalariforminen konjugaatio (nuolenkärki kuvassa 2a). Toisaalta kuvassa 2c näkyy solujen indusoima lateraalinen konjugaatio (nuoli kuvassa 2a). Zygosporit muodostuivat normaalisti lateraalisen konjugaation jälkeen (kuva 2d). Yamagishi (1977) raportoi, että S.castanacea -lajissa havaitaan yleensä skalariformista konjugoitumista, kun taas lateraalista oli harvoin. Tuloksemme oli yhdenmukainen Yamagishin (1977) tuloksen kanssa. Kuitenkin tietämyksemme rajoissa sekä skalariformisen että lateraalisen konjugaation indusoituminen samassa filamentissa (kuva 2a) on ensimmäinen raportti. Kun kaksi filamenttia parittui, toisen filamentin kaikki solut käyttäytyivät useimmissa tapauksissa urospuolisina ja toisen filamentin solut naaraspuolisina. Hyvin harvoin kuitenkin molemmissa filamenteissa muodostui zygosporeja (kuva 3). Näin ollen parittelutyyppi ei ole kiinteä ainakaan S.castanacea -lajissa. Hypnotsygootti muodostui inkuboimalla agarlevyllä noin 1 kuukauden ajan. Itämistä oli kuitenkin vaikea saada toistettavasti aikaan lisäämällä niihin closterium-mediumia. On löydettävä menetelmä, jolla itäminen voidaan toistettavasti indusoida.
Skalariformisten ja lateraalisten konjugaatioiden indusoiminen samassa filamentissa. a Sekä skalariformisia että lateraalisia konjugaatioita muodostui samassa filamentissa 48 tunnin inkuboinnin jälkeen. b Suurempi suurennos soluista, joissa näkyy skalariforminen konjugaatio a:ssa (nuolen pää). c Suurempi suurennos soluista, joissa näkyy lateraalinen konjugaatio a:ssa (nuoli). d Lateraalisen konjugaation kautta muodostuneet zygosporit 96 tunnin inkubaation jälkeen. Palkit 50 μm
Konjugaatio klooniviljelyssä. Agar-levyllä tapahtuneen 96 tunnin inkuboinnin jälkeen muodostui zygootteja. Zygosporeja muodostui molempiin säikeisiin. Palkki 50 μm
Tutkimme parittelun aikana erittyvien solunulkoisten materiaalien tunnistamista eri lektiinien avulla S. castanacea -lajissa. Tutkituista 19 lektiinistä (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL ja WGA) BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I ja SBA värjäsivät lisääntymiskykyisiä soluja, mutta eivät vegetatiivisia soluja (taulukko 1). Yoon ym. (2009) raportoivat, että kolme lektiiniä, Con A, RCA ja UEA, osoitti huomattavaa leimautumista solunulkoisissa materiaaleissa S. varians (Hassall) Kützingissä. Näin ollen konjugaation aikana erittyvät lektiinejä sitovat materiaalit näyttävät olevan jossain määrin erilaisia eri lajien välillä. Olemme aiemmin raportoineet, että BSL-I:n ja jakaliinin värjäytymismallit rhizoidissa olivat vastakkaiset: jakaliini värjäsi selvästi rhizoidin ääriviivat, kun taas BSL-I:n värjäytyminen oli hajanaista (Inoue ym. 1999, Ikegaya ym. 2008b). Oletettiin, että BSL-I:tä sitova materiaali on vastuussa filamenttien tarttumisesta alustaan. Toisaalta jakaliinia sitovan materiaalin arveltiin osallistuvan substraatin tunnistamiseen (Ikegaya ym. 2008b). Siksi tässä tutkimuksessa keskityimme BSL-I:hen ja jakaliiniin (kuva 4). Agar-levyllä tapahtuneen 48 tunnin inkuboinnin jälkeen kuvassa 4a esitetty filamentti muodosti papilloja eri suuntiin. Arveltiin, että tämä filamentti aloitti papillien muodostumisen kumppanifilamentin puuttuessa. BSL-I värjäsi voimakkaasti papillien pinnan. Myös solujen väliset septat värjäytyivät voimakkaasti. Seuraavaksi värjättiin pari filamenttia, jotka aloittivat konjugaation 48 tunnin inkubaation jälkeen. Kuvasta 4b voitiin päätellä, että ylempi filamentti oli urospuolinen sukusolu ja alempi naaraspuolinen sukusolu, koska filamentin alempien solujen halkaisija on suurempi kuin ylemmän filamentin solujen halkaisija. Parittaisista soluista pidentyneet konjugaatioputket värjäytyivät voimakkaasti, kun taas naaraspuolisten sukusolujen koko solupinta värjäytyi heikosti (kuva 4b′). 72 tunnin inkubaation jälkeen urospuolisen sukusolun koko solupinta oli myös heikosti värjäytynyt (kuva 4c′). Kun agarilevyllä oli inkuboitu 96 tuntia, zygosporeja muodostui (kuva 4d). Konjugaatioputket värjäytyivät voimakkaasti (kuva 4d′), kun taas zygosporien pinta ei värjäytynyt. Seuraavaksi tutkittiin värjäytymistä jakaliinilla. Kuvan 3e filamenttien solut muodostivat samansuuntaisia papilleja. Arvelimme, että tämä filamentti aloitti konjugaation kumppanifilamentin läsnä ollessa ja se hävisi siirron aikana objektilasille. Papillat värjäytyivät voimakkaasti jakaliinilla (kuva 4e′). Koko konjugaatioprosessin ajan jakaliini värjäsi pääasiassa konjugaatiokanavia (kuvat 4f′-h′). Myös Con A:n, RCA-I:n ja SBA:n värjäytymismallia tutkittiin (tietoja ei ole esitetty). Con A värjäsi voimakkaasti naaraspuolisten sukusolujen muodostamien zygosporeiden väliset septat, kun taas papillat värjäytyivät hyvin heikosti. Kun zygosporeja oli muodostunut, värjäytymismalli joko RCA-I:llä tai SBA:lla oli samanlainen kuin BSL-I:llä, kuten kuvassa 4d′ on esitetty.
Taulukko 1
Tutkimus eri lektiinien sitoutumisesta Spirogyracastanacea-suvun vegetatiivisiin ja lisääntymissoluihin
.
| Lektiinit | Vegetatiiviset solut | Reproduktiiviset solut | Spesifisyys |
|---|---|---|---|
| BSL-I | × | ○ | Gal α, GalNAc α |
| Con A | × | ○ | Man α, Glc α |
| Jakaliini | × | ○ | Sialyyli-Gal β1-3 GalNAc-O- |
| RCA I | × | ○ | Gal, GalNAc |
| SBA | × | ○ | GalNAc |
| WGA | × | × | (GlcNAc)n, sialiinihappo |
Solut värjäytyivät (○), eivät värjäytyneet lainkaan (×)
Filamenttien säilyminen suvullisessa lisääntymisessä BSL-I:llä ja jacalinilla. Agar-levyllä inkuboidut filamentit värjättiin joko fluoresceiinilla leimatulla BSL-I:llä tai jacalinilla (a′-h′). Kuvissa esitetään myös kirkkauskenttämikrokuvaukset (a-h). a′-d′ värjäys BSL-I:llä. Kun agarilla oli inkuboitu 48 tuntia, papillat muodostuivat eri suuntiin (a, a′) tai filamentit alkoivat konjugoitua (b, b′). Konjugoituneet filamentit 72 tunnin inkubaation jälkeen (c, c′). 96 tunnin inkubaation jälkeen muodostui zygootteja (d, d′). e′-h′ värjäys jakaliinilla. Kun agarilla oli inkuboitu 48 h, papillat muodostuivat samaan suuntaan (e, e′) tai filamentit alkoivat konjugoitua (f, f′). Konjugoituneet filamentit 72 tunnin inkubaation jälkeen (g, g′). 96 tunnin inkubaation jälkeen muodostui zygootteja (d, d′). Palkki 50 μm
Tutkimme kuuden lektiinin, BSL-I:n, Con A:n, jacalinin, RCA-I:n, SBA:n ja WGA:n, vaikutusta konjugaatioon. Filamentteja esi-inkuboitiin APW:ssä, jota täydennettiin jommallakummalla lektiinillä yhden päivän ajan. Sitten ne siirrettiin agarmaljalle, jota oli täydennetty samalla lektiinillä, ja niitä inkuboitiin 4 päivän ajan. Todettiin, että jakaliini esti voimakkaasti zygosporien muodostumista, mutta muut eivät (tietoja ei ole esitetty). Systemaattinen analyysi osoitti, että jakaliini esti vakavasti aivan alkuvaiheen, papillan muodostumisen aloittamisen (kuva 5). Seuraavaksi tutkittiin jakaliinin aiheuttaman eston palautuvuutta. Filamentteja inkuboitiin peräkkäin APW:ssä, jota oli täydennetty jakaliinilla, yhden päivän ajan ja sitten APW:ssä, josta puuttui jakaliini, yhden päivän ajan. Sen jälkeen niitä inkuboitiin agarlevyllä, josta puuttui jakaliini, 4 päivän ajan. Papillaa ei kuitenkaan muodostunut lainkaan. Tämä peruuttamaton inhibitio saattaa johtua jakaliinin voimakkaasta sitoutumisesta. Yoon et al. (2009) raportoivat, että RCA ja UEA estivät konjugaatiota. He eivät kuitenkaan tunnistaneet inhiboinnin vaihetta. Vaikka BSL-I, RCA-I, Con A ja SBA värjäsivät myös konjugaatioputkea, ne eivät estäneet sen muodostumista. Joko BSL-I:n, RCA-I:n tai SBA:n tunnistamien aineiden roolit ovat tulevien tutkimusten kohteena.
Lektiinien vaikutus konjugaatioputken muodostumisen käynnistymiseen. Noin 100 filamenttia inkuboitiin APW:ssä, jota oli täydennetty joko 1 μg/ml BSL-I:llä, Con A:lla, jacalinilla, RCA-I:llä, SBA:lla tai WGA:lla, 23 °C:ssa 12:12 h L-D-syklissä 1 vuorokauden ajan, minkä jälkeen filamentit siirrettiin agarmaljalle, jota oli täydennetty samalla lektiinillä, ja niitä inkuboitiin 4 vuorokautta. Kun papillaa havaittiin, arvioimme, että solu aloitti konjugaation. Tulokset esitettiin konjugaatioputken muodostamisen aloittaneiden filamenttien suhteena filamenttien kokonaismäärään. Kokeet toistettiin 4 kertaa, ja tiedot esitetään keskiarvona ja SEM
Randhawa (1959) ehdotti konjugaatioprosessien ja juurakonmuodostuksen samankaltaisuutta: kontaktiärsyke on mukana. Toisaalta Kniep (1928) uskoi, että konjugaatioprosessit johtuvat pääasiassa kemiallisesta ärsykkeestä (siteerattu Randhawassa (1959)). Sekä konjugaatioputki että juurakko alkavat papillan muodostumisen kautta ja voivat pidentyä kärkikasvun kautta. Konjugaatioputki muodostuu kuitenkin kylkeen, mutta juurakko muodostuu solun distaaliseen päähän (Nagata 1973). Jakaliini värjäsi selvästi sekä konjugaatioputken (kuva 3e′-h′) että ritsoidin ääriviivat (Ikegaya ym. 2008b). Jalakaliini ei estänyt juurakon muodostumista, mutta esti erilaistumisen ruusukkeen muotoiseksi juurakoksi (Ikegaya ym. 2008b). Konjugaatioputkien tapauksessa jakaliini kuitenkin esti papillan muodostumisen sinänsä (kuva 5). Vaikuttaa siltä, että jakaliinia sitovan materiaalin rooli on erilainen konjugaatioputkessa ja juurakossa.
Konjugaation toistettavan induktion onnistuminen laboratoriossa avasi tien Spirogyran konjugaation systemaattisille analyyseille, kuten solujen seksuaalisuuden määritysmekanismille, lektiiniä sitovien materiaalien roolille ja urospuolisen protoplastin liikemekanismille.