Suurimmassa osassa IHC/ICC-menetelmiä kudokset ja solut fiksoidaan formaldehydipohjaisilla fiksatiiveilla. Alla olevassa protokollassa kuvataan tekniikka 4-prosenttisen formaldehydiliuoksen valmistamiseksi PBS:ään. Tehokkain fiksatiivi on määritettävä kokeellisesti.
Varoitus: Formaldehydi on myrkyllistä. Lue käyttöturvallisuustiedote ennen työskentelyä tämän kemikaalin kanssa. On käytettävä käsineitä ja suojalaseja, ja liuokset on valmistettava huuruhuoneessa.
Lue protokolla kokonaisuudessaan ennen aloittamista.
Tarvittavat reagenssit
- Deionisoitu H2O
- HCl (laimea)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldehydijauhe
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materiaalit
- Suodatinyksiköt
- Lasitavarat ja sekoitustanko (formaldehydiliuokselle tarkoitettu)
- Käsineet ja silmiensuojaimet
- Kuumalevy magneettisekoittimella
- Lämpömittari
- Tuuletettu huppu
.
Menetelmä
- 1 L:lle 4 %:n formaldehydiä, lisätään 800 ml 1X PBS:ää lasiseen dekantterilasiin sekoituslevylle tuuletetussa hupussa. Kuumenna sekoittaen noin 60 °C:een. Varo, ettei liuos kiehu.
- Lisää 40 g paraformaldehydijauhetta lämmitettyyn PBS-liuokseen.
- Jauhe ei liukene välittömästi liuokseen. Nosta pH:ta hitaasti lisäämällä 1 N NaOH:ta pisaroittain pipetistä, kunnes liuos kirkastuu.
- Kun paraformaldehydi on liuennut, liuos jäähdytetään ja suodatetaan.
- Säädä liuoksen tilavuus 1 L:ksi 1X PBS:llä.
- Tarkista pH uudelleen ja säädä se pienillä määrillä laimennettua HCl:a noin arvoon 6.9.
- Liuosta voidaan ottaa alivuotisia määriä ja pakastaa tai säilyttää 2-8 °C:ssa enintään kuukauden ajan.
Paraformaldehydin, formaldehydin ja formaliinin ero
Paraformaldehydi (kemiallinen nimi polyoksimetyleeni) on jauhemainen polymerisoitunut formaldehydi, joka ei itsessään kykene kiinnittämään kudoksia. Jotta paraformaldehydiä voitaisiin käyttää kudosten kiinnitysaineena, se on liuotettava kuumaan veteen formaldehydiliuokseksi. Formaliini on kyllästetty formaldehydiliuos vedessä (37 painoprosenttia, 40 tilavuusprosenttia), joka sisältää 10-15 prosenttia metanolia. Metanolia lisätään hidastamaan polymeroitumista formaldehydiksi, mikä vähentää formaliinin kiinnityskykyä. Formaliinia voidaan valmistaa myös alkoholittomassa muodossa jauhemaisesta paraformaldehydistä.