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Par G.P. ThomasApr 15 2013

Crédits image : khawfangenvi16/.com

La chromatographie liquide à haute performance ou chromatographie liquide à haute pression (CLHP) est une méthode chromatographique qui est utilisée pour séparer un mélange de composés en chimie analytique et en biochimie de façon à identifier, quantifier ou purifier les composants individuels du mélange.

La CLHP en phase inversée ou chromatographie liquide à ultra-haute performance (CLUHP) est un mode de séparation couramment utilisé. Il permet une rétention dynamique des composés possédant des fonctionnalités hydrophobes et organiques. Une combinaison d’interactions hydrophobes et de type van der Waals entre l’ensemble du composé cible et les phases stationnaire et mobile permet la rétention de ces composés par phase inversée.

Comment fonctionne la HPLC ?

En très petite quantité, le mélange d’échantillons à séparer et à tester est envoyé dans un flux de phase mobile percolant via une colonne. Il existe différents types de colonnes avec des sorbants de tailles de particules et de surfaces variables.

Le mélange se déplace dans la colonne à des vitesses variables et interagit avec le sorbant, également appelé phase stationnaire. La vitesse de chaque composant du mélange dépend 1) de sa nature chimique, 2) de la nature de la colonne et 3) de la composition de la phase mobile. Le temps auquel un analyte spécifique émerge de la colonne est appelé son temps de rétention. Le temps de rétention est mesuré dans des conditions spécifiques et considéré comme la caractéristique d’identification d’un analyte donné.

Les particules absorbantes pourraient être de nature hydrophobe ou polaire. Les phases mobiles couramment utilisées comprennent toute combinaison miscible d’eau et de solvants organiques tels que l’acétonitrile et le méthanol. Des phases mobiles sans eau peuvent également être utilisées.

Le composant aqueux de la phase mobile pourrait contenir des acides comme l’acide formique, phosphorique ou trifluoroacétique ou des sels pour permettre la séparation des composants de l’échantillon. La composition de la phase mobile est soit maintenue constante, soit variée au cours de l’analyse chromatographique. L’approche constante est efficace pour la séparation des composants de l’échantillon qui ne sont pas très différents dans leur affinité pour la phase stationnaire. Dans l’approche variée, la composition de la phase mobile varie d’une force d’élution faible à une force d’élution élevée. La force d’élution de la phase mobile est reflétée par les temps de rétention des analytes où une force d’élution élevée produit une élution rapide.

La composition de la phase mobile est choisie en fonction de l’intensité des interactions entre plusieurs composants de l’échantillon et la phase stationnaire.

Le processus de partitionnement HPLC est assez similaire au processus d’extraction liquide-liquide, sauf que le premier est un processus continu, contrairement au second qui est un processus par étapes. Il est recommandé d’effectuer des essais de partitionnement pour déterminer la méthode HPLC exacte qui permettrait une séparation adéquate.

Fabricants de systèmes HPLC

Il existe une large gamme d’options HPLC sur le marché aujourd’hui. Voici une liste de divers fabricants de systèmes HPLC avec une brève présentation de leurs produits :

• Dionex, une société basée sur la science de la chromatographie, fabrique le système LC à séparation rapide UltiMate® 3000, le système UltiMate 3000 RSLCnano et la famille Corona® de détecteurs universels d’aérosols chargés.
• Jasco Analytical Instruments fournit une gamme de systèmes HPLC. Les systèmes HPLC de la série LC-2000 Plus sont configurables de manière unique. Avec des performances élevées et un faible coût, ces systèmes HPLC peuvent être adaptés à pratiquement toutes les exigences, du simple AQ isocratique au développement avancé de méthodes multi-solvants/multicolonnes. Le LC-2000plus-Iso isocratique est équipé d’une pompe, d’un dégazeur, d’un échantillonneur automatique et d’un détecteur UV/Vis. La pompe est conçue avec des débits de 1µL à 10mL/min à des pressions allant jusqu’à 500 bar pour une utilisation avec des colonnes de 2, 3, 4, 6 et jusqu’à 10mm ID. Le système à gradient binaire LC-2000plus-HPG est similaire au système isocratique, mais il est doté d’une configuration de pompe à gradient à deux solvants. Les débits de la pompe sont compatibles avec les colonnes de 1 mm. Le LC-2000plus-LPG à gradient quaternaire est également similaire au système isocratique ; cependant, ce modèle est pourvu d’une configuration de pompe à gradient quaternaire pour une flexibilité maximale des solvants.
• Le système HPLC préparatif de Gilson possède une large plage de débit qui peut être adaptée aux séparations semi-préparatives et préparatives. Sa puissance de pompage élevée permet une large gamme de tailles de colonnes préparatives. Le système est conçu avec un nouveau système de station de rinçage comprenant un lavage à jet fluide et permet d’utiliser jusqu’à deux solvants de rinçage différents.
• Les systèmes HPLC Sharp™ de AAPPTec sont pourvus de pompes contrôlées par microprocesseur, permettant ainsi des débits très précis et très exacts, ce qui peut aider à obtenir une excellente reproductibilité analytique et la plus grande exactitude de mesure.

Les autres fabricants présents sur le marché actuel sont Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad et Buck Scientific.

Avantages de l’HPLC

Les principaux avantages des systèmes HPLC sont les suivants :

• Contrôle et automatisation de l’instrumentation chromatographique
• Fournit une gestion des données, des fonctions de sécurité, ainsi que des rapports et une validation des instruments.
• Puissant et adaptable
• Augmente la productivité en gérant tous les domaines de l’analyse – de l’échantillon à l’instrument, et de la séparation au rapport des résultats.
• Affordable

Applications de la HPLC

Le but principal de la technique HPLC est d’identifier, de quantifier et de purifier un analyte ou un composé particulier. Des analyses quantitatives et qualitatives peuvent être effectuées. Les HPLC peuvent être utilisées dans les applications suivantes :

• Purification de l’eau
• Détection des impuretés dans les industries pharmaceutiques
• Préconcentration des composants à l’état de traces
• Chromatographie d’échange de ligands
• Chromatographie d’échange d’ions des protéines
• Chromatographie d’échange d’anions à pH élevé.exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides

Sources et lectures complémentaires

• Chromatographie HPLC/UHPLC en phase inversée-.Phenomenex
• Produits Dionex
• Systèmes HPLC-aapptec
• Système HPLC préparatif-Gilson

Cet article a été mis à jour le 22 avril, 2019.

Écrit par

G.P. Thomas

Gary est diplômé de l’Université de Manchester avec une mention très bien en géochimie et une maîtrise en sciences de la terre. Après avoir travaillé dans l’industrie minière australienne, Gary a décidé de raccrocher ses bottes de géologue et de se tourner vers l’écriture. Lorsqu’il n’est pas en train de développer du contenu d’actualité et informatif, Gary peut généralement être trouvé en train de jouer de sa guitare bien-aimée, ou de regarder Aston Villa FC arracher la défaite des mâchoires de la victoire.

Citations

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