Bevezetés
Néhány betegségnek genetikai alapja van. Némelyik egy adott fehérje hiányának vagy diszfunkciójának következménye, amely a kódoló gén mutációi miatt következik be. Ez a helyzet a mendeli öröklődésű betegségek esetében, mint például a Huntington-kór, a talasszémia és körülbelül 1000 egyéb öröklődő ritka betegség.1 Sok betegségnek van genetikai alapja, még akkor is, ha nem kizárólag egyetlen gén mutációjára vezethető vissza, és egyre több genetikai variánst és polimorfizmust azonosítanak az összetett betegségek kockázati tényezőjeként.2 A rák olyan genetikai betegség, amelyet egy vagy több gén mutációja okoz, amelyek vagy növelik a rák kockázatát (például csíravonal-mutációk), vagy elősegítik a rák kialakulását (onkogének), vagy károsítják a sejtproliferációt szabályozó sejtmechanizmusokat (szupresszor gének), ahogyan az a szomatikus mutációk esetében történik.3
A betegségek genetikai alapjainak azonosítása néhány évvel ezelőttig munkaigényes és kihívást jelentő feladat volt. Ezek a projektek gyakran azzal kezdődtek, hogy genetikai asszociációs vizsgálatokkal azonosították a betegség átvitelében esetleg szerepet játszó genomrégiót.1 A betegség átvitelével nagymértékben összefüggő genomrégió meghatározásához általában nagy, több érintett tagot számláló családok elemzésére van szükség. Általában ez a régió több gént tartalmaz, amelyeket szekvenálni kell ahhoz, hogy domináns öröklődés esetén azonosítani lehessen egy olyan génmutációt, amely az összes érintett egyénben jelen van, egészséges rokonaikban pedig nem. Recesszív öröklődés esetén a mutációnak jelen kell lennie az érintett tagok mindkét alléljában, és a nem érintett rokonok egyik alléljában vagy egyikben sem.
A genetikai betegségek diagnosztizálása ugyanilyen munkaigényes volt, és a legtöbb esetben még ma is az. A legjobb esetben a betegség egyetlen gén mutációjából eredhet. A diagnózis felállításához csak ennek a génnek a nukleotidszekvenciáját kellene meghatározni. Általában a gént polimeráz láncreakcióval több fragmentumként amplifikálják, és mindegyiknek meghatározzák a nukleotidszekvenciáját. Gyakran előfordul, hogy a betegséget több gén bármelyikének mutációja okozhatja, és mindegyiket fel kell amplifikálni és szekvenálni kell ahhoz, hogy az érintett betegeknél megtalálják a betegség genetikai eredetét. A dyskeratosis congenita esetében például a dkc, tert, terc, NOP10, NH2 vagy TINF2 gének bármelyikében találhatók mutációk, és az érintett gének száma még ennél is nagyobb lehet, mivel van a betegek egy része, akiknél nem sikerült azonosítani az okozó mutációt.4,5 Mindezen gének nukleotidszekvenciáját meg kell határozni az egyes betegek molekuláris diagnózisához. A különböző ráktípusokban számos mutáns gént találunk.3 A molekuláris diagnózishoz több ilyen gén nukleotidszekvenciájának meghatározása szükséges. Jelenleg ez egy munkaigényes és költséges eljárás, amely nem alkalmazható a betegek nagy populációjánál. A gyakorlatban csak néhány olyan gént szekvenálnak a diagnózis és a kezelés érdekében, amelyek az egyes ráktípusokban érintett betegek jelentős hányadában mutálódnak.
Csak az utóbbi néhány évben fejlesztettek ki olyan technikákat, amelyek egy adott mintában több szekvencia-variáns egyidejű kimutatására alkalmasak. Ezek közül sok a dezoxiribonukleinsav (DNS) microarray technológián alapul. A genotipizáló tömbökben az adott betegséggel kapcsolatos, aktívan azonosított mutációkat tartalmazó oligonukleotidokat egy tárgylemezre helyezik. A beteg DNS-mintáját a tárgylemez tetejére helyezik, és a hibridizáló oligonukleotidokat azonosítják. Egyetlen microarray hibridizációval több millió ismert mutáció vizsgálható.6 A másolatszám-változásokat is lehet elemezni olyan DNS-mikroarray-kkel, amelyeket a beteg DNS-ében duplikált vagy deletált DNS-régiók jelenlétének kimutatására terveztek.7 Ezeket a technikákat gyakran használják az orvosi kutatásban és a klinikai diagnosztikában.8
A molekuláris orvostudományban azonban jelentős előrelépés volt a közelmúltban a tömeges szekvenálási technológiák kifejlesztése, amelyek lehetővé teszik a beteg DNS-ének nukleotidszekvenciájának rövid idő alatt és megfizethető áron történő meghatározását.9,10 Ezek a módszerek 2005 óta használatosak, és több millió DNS-fragmentum nukleotidszekvenciájának egyidejű meghatározásán alapulnak. Második generációs szekvenálásnak, új generációs szekvenálásnak, mélyszekvenálásnak vagy tömegesen párhuzamos szekvenálásnak nevezik őket. Ezekkel a gépekkel legfeljebb 2 hét alatt több ezer millió nukleotidszekvenciát határoznak meg. Ezen új szekvenáló rendszerek kapacitásának példájaként jegyezzük meg, hogy az első emberi genom mérföldkőnek számító, 2001-ben közzétett szekvenálása11 23 laboratórium összehangolt munkáját igényelte, amely 13 évig tartott, és összesen mintegy 3 milliárd USD költséggel járt. Az új módszerekkel egy emberi genom szekvenálása egy laboratóriumot és körülbelül 2 hetet vesz igénybe, megközelítőleg 4000 USD költséggel.
A modern szekvenálási módszerek elérhetősége az emberi genomról, az egyének közötti variabilitásról és a betegségek genetikai variánsainak azonosításáról szóló ismereteink exponenciális növekedését eredményezi. Ezek a módszerek képezik például a folyamatban lévő 1000 Genom projekt12 alapját, amelynek célja mintegy 1000 különböző földrajzi és etnikai eredetű személy teljes nukleotidszekvenciájának meghatározása az egyének közötti átlagos szekvencia-variáció meghatározása és a leggyakoribb polimorfizmusok azonosítása érdekében.
A szekvenálási technológiák jelenleg gyors ütemben fejlődnek. Kisebb és gyorsabb gépeket fejlesztenek, és új szekvenálási módszereket vezetnek be. Fontos cél például az egyedi sejtek egyetlen DNS-molekulájának szekvenálása.13,14 A technikai kihívások mellett a fejlődés folyamatosan csökkenti a DNS-szekvenálás árát, így néhány éven belül elérhetőnek tűnik az a cél, hogy 1000 dollárért szekvenáljanak egy egyedi emberi genomot. Jelenleg a teljes emberi genom szekvenálása és az összes keletkezett szekvenciaadat elemzése összetett, költséges és időigényes, ezért számos vizsgálatot a genom egy kisebb részén végeznek. Különösen nagy figyelmet fordítanak jelenleg a genom fehérjéket kódoló régiójának, az úgynevezett exomnak a szekvenálására. Az exom szekvenálás sokkal megfizethetőbb, mint a teljes genom szekvenálás, és ebben az áttekintésben ennek a technikának a lehetőségeit, előnyeit és korlátait tárgyaljuk.
Mi az exom?
Majdnem minden emberi fehérjekódoló gén diszkontinuus szerkezetű. A fehérjét kódoló régió több darabra, úgynevezett exonokra tagolódik. Az exonokat nem fehérjekódoló DNS-töredékek, azaz intronok kötik össze, amint azt az 1. ábra sematikusan mutatja. A gének átíródása a promóter régióból történik több szabályozó régió irányítása alatt, amelyek a génhez képest különböző helyeken, a géntől felfelé, lefelé vagy akár a gén belsejében is jelen vannak. A transzkripció során egy elsődleges átirat jön létre, amely exonokat és intronokat tartalmaz. Az ezt követő ribonukleinsav (RNS) splicing folyamatok törlik az intronokat és egyesítik az exonokat, hogy létrehozzák az érett hírvivő RNS-t (mRNS), amely csak egy folyamatos fehérjekódoló régiót tartalmaz. A legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy a legtöbb gén elsődleges transzkriptuma többféleképpen is splicelhető, így különböző érett mRNS-ek keletkeznek, amelyek az exonok meghatározott kombinációit tartalmazzák, ezeket alternatív splicing-variánsoknak nevezzük (1. ábra). Ezek az mRNS-ek olyan fehérjeizoformákat kódolnak, amelyeknek vannak közös régióik, de a beépített exonoktól függően különböznek is egymástól.15
Az emberi genom elemzése kimutatta, hogy a fehérjéket kódoló gének a DNS kis részét, mindössze mintegy 3%-át teszik ki.16 Az exonok még kisebb hányadot, a genom 1%-át képviselik.16 Ezen adatok összefoglalása az 1. táblázatban látható. Az emberi genom 3,3 × 109 bázispárból (bp) áll, és 20 078 fehérjekódoló gént tartalmaz.17 Minden gén átlagosan nyolc exonra oszlik, amelyek mindegyike körülbelül 170 bp hosszú. Az összes exon összességében körülbelül 3 ×107 bp-t tartalmaz. Az összes exon szekvenálása azonban ugyanolyan információt nyújt a kódolt fehérjék aminosav-szekvenciájáról, mint a teljes genom szekvenálása, kivéve az mRNS-splicinget megváltoztató mutációkat, amint azt az Exom-szekvenálás és adatelemzés című fejezetben tárgyaljuk. Az összes exon szekvenálásának ezt a rendszerét exomszekvenálásnak nevezték el, és az összes emberi fehérje aminosav-szekvenciájában lévő eltérések kimutatásának érvényes módszerévé vált.18 A nagyon jelentős méretkülönbség miatt az exomszekvenálás sokkal olcsóbb, mint a genomszekvenálás, és ez megkönnyíti a keletkezett szekvenciaadatok számítási és funkcionális elemzését.
  |
1. ábra A génszerkezet és a génexpresszió sematikus ábrázolása. |
 |
Táblázat 1. Az emberi genom és az exom általános jellemzői |
Exom-befogási technikák
Az exom-szekvenálás első és legkritikusabb lépése az exonok izolálása vagy befogása. Az alkalmazott módszerek DNS-hibridizáción alapulnak. Az emberi genom elemzése lehetővé tette az összes génexon azonosítását, és megkönnyíti az egyes génekre specifikus oligonukleotid szondák tervezését. A szondákat az exonok DNS-ből történő tisztítására használják.19 A DNS 500 bp-nél nem nagyobb darabokra történő fragmentálása az első lépés. Ezután a DNS-t az exon-specifikus oligonukleotid szondákhoz hibridizáljuk, és a hibridizált fragmentumokat megtisztítjuk. A hibridizáció folyékony fázisban is elvégezhető. Ebben az esetben az oligonukleotidokat megjelölik, így a DNS-oligonukleotid komplexek elválaszthatók a nem hibridizált DNS nagy részétől. Egy gyakori példában az oligonukleotidokat kovalensen biotinhoz kötik, így a DNS-oligonukleotid hibridek a mágneses gyöngyökhöz kapcsolt biotin-kötő molekula, a streptavidin segítségével izolálhatók. Az exonokat nem tartalmazó DNS-töredékek nem kötődnek a streptavidin gyöngyökhöz, és több mosási lépés után hatékonyan eltávolíthatók. Az exonokat tartalmazó, a gyöngyökhöz kötött fragmentumok a DNS-oligonukleotid hibridek alacsony ionerősségű körülmények között történő disszociációja után nyerhetők ki.
Az exonokat szilárd hordozóra történő hibridizációval is izolálhatjuk, ahol az exon-specifikus oligonukleotidokat foltoztuk, mint a DNS-mikrocsíkok esetében. Ebben az esetben a fragmentált DNS-t az oligonukleotidokra terítik, hogy lehetővé tegyék a hibridizációt. Később a nem hibridizált DNS-t kimossuk, és az exonokkal dúsított DNS-t alacsony ionos körülmények között eluáljuk.
Változatos kereskedelmi szállítók kínálnak készleteket az exomok folyadékfázisú hibridizációs protokollok segítségével történő izolálásához, köztük az Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA), a Roche NimbelGen, Inc. (Madison, WI, USA), Illumina, Inc. (San Diego, CA, USA) és a Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Ezek a készletek lehetővé teszik a genomban található exonok több mint 90%-ának izolálását, több mint 90%-os specificitással, exomononként megközelítőleg 150 USD áron. Több szerző is összehasonlította ezeket az exome capture platformokat,20-22 és a Clark és munkatársai22 által a SureSelect Human All Exon 50 Mb (Agilent Technologies), a Roche NimbleGen, Inc. SeqCap EZ Exome Library v2.0 és az Illumina, Inc. TruSeq Exome Enrichment kitjeit összehasonlító adatokat a 2. táblázat foglalja össze. A kitek némelyike a fehérjekódoló régiók mellett az mRNS nem transzlált régióit is lefedi, és ez lehetővé teszi a szabályozó régiók, például a mikroRNS (miRNS) kötőhelyek elemzését. Az 5′ nem transzlált régiók bevonása lehetővé teszi a proximális promóter régiók elemzését is.22 Ezenkívül a legtöbb kit a miRNS-kódoló régiók akár 80%-át is lefedi.21 A közelmúltban ezek és más szállítók továbbfejlesztett kiteket fejlesztettek ki, így a 2. táblázatban szereplő adatokat csak jelzésértékűnek kell tekinteni. Fontos megjegyezni, hogy az exonok tisztítása kritikus lépés. Az exonok 100%-ának visszanyerése nehéz, és az exonok gyakran elvesznek vagy alulreprezentáltak az izolált exomban. Ha például egy beteg exomját elemzik, és az exonok 10%-a elvész a tisztítás során, akkor a releváns mutáció kihagyásának valószínűsége körülbelül 10% lesz e technikai hiba miatt. Ezért az exom-szekvenálásban kritikus jelentőségű a nagy hatékonyságú exon-megfogási eljárások alkalmazása.
 |
2. táblázat A három fő exom-megfogási platform összehasonlítása |
Exom szekvenálás és adatelemzés
Az exonokat tartalmazó fragmentumok szekvenálása a jelenleg elérhető masszív szekvenáló berendezésrendszerek vagy technológiák bármelyikével történik. Amint a bevezetőben említettük, ezek a platformok egyszerre több millió DNS-fragmentum nukleotidszekvenciáját határozzák meg. Az exomszekvenálás során az egyes fragmentumok szekvenciájának meghatározott hossza nem hosszú, jellemzően 35 bp és 100 bp között van. Mivel azonban a DNS-t kezdetben véletlenszerűen fragmentálták, minden egyes nukleotid sok egymást átfedő fragmentumban lesz jelen. Ezért, ha elég nagy számú szekvenciát kapunk, még ha rövidek is, minden bázis egymástól függetlenül több DNS-töredékben is szekvenálásra kerül. Az egyes bázisok szekvenálásának számát nevezzük lefedettségnek vagy szekvenálási mélységnek. A lefedettség közvetlen kapcsolatban áll a generált nukleotidszekvencia minőségével és megbízhatóságával. Általában 20×-30×-os lefedettséget tartanak szükségesnek ahhoz, hogy megbízható eredményeket kapjunk az exomszekvenálásban.59 Ez a szekvenálási mélység azt jelenti, hogy egy lehetséges szekvencia-variációt 20-30 különböző DNS-fragmentumban egymástól függetlenül szekvenáltak.
Az exomszekvenálási projektek utolsó lépése az adatelemzés (2. ábra). Mint már említettük, több millió szekvencia adatai keletkeznek, és ezek elemzése speciális és összetett számítógépes programokat és szakértelmet igényel.19,23 Az előzetes lépés a keletkezett szekvencia minőségének elemzése. Vizsgálják a szekvenciaolvasás pontosságát különböző szekvenciahosszúságok esetén, a leolvasások átlagos hosszát, valamint egyéb paramétereket. Ha a minőség elég jó, minden egyes szekvenciát összehasonlítanak egy referenciaszekvenciával, amely általában a humán genomszekvencia utolsó elérhető változata. Általában a generált szekvenciák több mint 80%-a illeszthető a referencia genommal.22 Ez a lépés lehetővé teszi a nukleotidok kis mértékű eltérését a referencia genomhoz képest. Az elemzés következő lépése a referencia-szekvencia és a tanulmányunkban kapott exomszekvencia közötti szekvencia-változások azonosítása. Ezeknek a variánsoknak a későbbi elemzése szolgáltathatja a kívánt információt a vizsgált orvosi problémáról.
 |
2. ábra Exom szekvenálási adatok elemzése. |
Az exomszekvenálással többféle genetikai variációt lehet kimutatni. Az egyik leggyakrabban talált eltérés az egyik nukleotidnak egy másikra történő cseréje, például A helyett G (ATA kodonból ATG). Ezeket a változásokat egynukleotid-variánsoknak (SNV) nevezzük, bár akkor tekintjük őket egynukleotid-polimorfizmusoknak (SNP), ha gyakoriságuk a populációban nagyobb, mint 1-5%, és nincs erős hatásuk valamely betegség kockázatára. A legtöbb SNV néma, vagy más néven szinonim, mivel mindkét szekvencia-változat ugyanazt az aminosavat kódolja (például a GCA GCC-re történő változása, mivel mindkettő alanin kodon). E polimorfizmusok többsége nem jelent semmilyen különbséget a kódolt fehérje szempontjából, nem áll evolúciós szelekció alatt, és a humán exomban leggyakrabban előforduló variációkat képviselik. Kivételt képeznek egyes csendes mutációk, amelyek a splicing-szabályozó jeleket vagy akár a transzkripciót szabályozó helyeket érintik, megváltoztatva az mRNS splicinget vagy expressziót még akkor is, ha nem változtatják meg a kódolt aminosavakat. Más esetekben a nukleotidvariációnak következménye van a kódolt fehérjében, és ezek a nem csendes vagy nem szinonim változatok. Ezek a változások a kódolt aminosav variációját eredményezhetik (például a GAT GAG-ra változtatja az aszparaginsavat glutaminsavra), és ezeket miszense mutációknak nevezzük. Még drasztikusabb változások jönnek létre, amikor a nukleotidvariáció egy transzlációs stopkódont hoz létre (például a TGC TGA-ra változtatja a cisztein kodont stopkódonná), amit nonszensz mutációnak nevezünk. Van olyan típusú SNV is, amely exomszekvenálással akkor is kimutatható, ha nem befolyásolja a fehérjekódonokat. Mivel az exonokat a DNS véletlenszerű fragmentálása után választják ki, azok összefüggő DNS-régiókat is tartalmazhatnak, beleértve a szomszédos intronszekvenciákat és még a gén promótereit is, ha nem transzlált régiók kerültek befogásra.24 Az intronrégiók tartalmazzák az mRNS-splicinghez szükséges szabályozó jeleket. Az ezekben a régiókban található SNV-k különböző módon módosíthatják a splicinget.15 Például az érintett intron megmaradhat az érett mRNS-ben, vagy a szomszédos exon ki is splicingelődhet (exon skipping). Ezek a változások megváltoztatják az érett mRNS nukleotidszekvenciáját, és így az SNV után kódolt fehérjét is.25 Az exom szekvenálással kimutathatók a kis inszerciók vagy deléciók (indelek) okozta szekvencia-változások is.22 Ezek a változások frame shiftet eredményezhetnek, kivéve, ha három vagy három nukleotid többszörösét érintik. Ebben az esetben kis aminosavak delécióit vagy inszercióit eredményeznék.
A kórokozó mutációk azonosítása
A kimutatott szekvenciavariánsok funkcionális jelentőségét a következő adatelemzési lépésben kell meghatározni. Még ha genetikai szempontból minden ember közel azonos is, az egyének között jelentős a nukleotidszekvencia-eltérések száma.26 Ez a heterogenitás megnehezíti az egyes szekvenálási projektek során kapott adatok értelmezését. Az egyéni szekvencia-variációk néhány általános adatát a 3. táblázat mutatja be. A teljes genomot tekintve az 1000 Genom projekt és kisebb teljes genom szekvenálási projektek során kapott adatok alapján az egyének közötti szekvencia eltérések számát 4 × 106-ra becsülik.27 Az exomok kisebb, de még mindig jelentős számú szekvencia eltérést mutatnak, amelyek száma körülbelül 20 000-25 000 bármely két, egymással nem rokon személy között.27,28 E genetikai eltérések többsége néma, amint azt korábban tárgyaltuk. Az egyének közötti nem csendes szekvencia-különbségek számát 10 000-re becsülik. E variánsok többsége az általános populációban létezik, és generációkon keresztül öröklődik. Becslések szerint minden egyénben kevesebb mint egy nem csendes SNV jelenik meg de novo.29
Az exomszekvenálási projektekben nyert adatokat gyakran szűrik, hogy azonosítsák az összes olyan SNP-t, amely más egyénekben is jelen van, és ezért nem kapcsolódik a vizsgált betegséghez.2,19,23 Ezt a folyamatot nyilvános adatbázisokkal való összehasonlítással lehet elvégezni, ahol a szekvenálási projektekben talált SNP-ket összegyűjtik. Figyelembe kell venni azt a fenntartást, hogy minden nagy adatbázis számos bizonyítottan viszonylag gyakori betegséget okozó mutációt tartalmaz. E szűrési lépés után körülbelül 400-700 új, esetleg releváns SNV marad (3. táblázat).28 A következő kihívás annak meghatározása, hogy a globális populációban nem jelenlévő SNV-k közül – ha vannak ilyenek – melyek azok, amelyek a vizsgált betegség hátterében állnak. A megfigyelt különbségek közül sok nem lesz kapcsolatban a betegség semmilyen előfordulási gyakoriságával, és ezeket utasváltozásoknak nevezzük.23 Ezzel szemben egy vagy néhány változásnak okozati szerepe lehet, és ezeket hívjuk vezető változásoknak. A vezető változások azonosítására alkalmazott megközelítés a vizsgálat sajátos körülményeitől függ. A mendeli öröklődési mintázatú betegségek esetében általában számos érintett és nem érintett egyedet kell elemezni ahhoz, hogy megtaláljuk azokat a génváltozásokat, amelyek tökéletesen szegregálódnak a betegséggel. Ez az összehasonlítás nagy családokban, jól jellemzett törzskönyvekkel rendelkező családok esetében sokkal informatívabb. Kellően nagy érintett családok hiányában számos nem rokon beteg és kontroll összehasonlítása szintén lehetővé teszi a vezető gének azonosítását. A betegséggel összefüggő lehetséges SNV-k kiválasztásához további kritériumokat használnak, többek között olyan in silico algoritmusokat, amelyek a mutálódott aminosav lehetséges jelentőségét az evolúciós konzerváció, valamint a fehérje szerkezetére és funkciójára gyakorolt előre jelzett hatás alapján jelzik előre. A mutálódott fehérje előre jelzett funkciója és szövetspecifikus expressziós mintázata szintén kritériumok a feltételezett okozó mutációk kiválasztásában.
 |
3. táblázat Az egyének közötti szekvenciavariáció összefoglalása |
Az ilyen típusú vizsgálatok néhány példáját egy későbbi szakaszban ismertetjük. Mivel azonban egyre több vizsgálatot végeznek, egyre több génváltozatot azonosítanak az örökletes betegségek okozójaként, ami valószínűsíti, hogy a betegben mutálódott gének egy részét már leírták volna. Ezek a mutálódott gének megtalálhatók az irodalomban és olyan speciális adatbázisokban, mint az Online Mendelian Inheritance in Man adatbázis (http://www.omim.org). A különböző génekben talált mutációk lehetséges relevanciája a Genome Ensemble oldalon (http://www.ensembl.org/) is kereshető, ha azokat korábban már leírták.
A rák valószínűleg a genetikai alapon kialakuló betegségek legelterjedtebb csoportja. Számos vizsgálat irányult a különböző ráktípusok vezető génjeinek meghatározására.30 A rák vezető génjeinek kialakult csoportja olyan adatbázisokban kereshető, mint a Catalogue of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC; http://cancer.sanger.ac.uk) vagy a The Cancer Genome Atlas (http://cancergenome.nih.gov/). Számos részletesebb példát mutatunk be az Exomszekvenálás klinikai felhasználásának példái című részben.
Az exomszekvenálás összehasonlítása más tömeges szekvenálási megközelítésekkel
Genomszekvenálás
Amint a bevezetőben említettük, a teljes emberi genom szekvenálása egyre inkább megfizethetővé válik. Az exom-szekvenáláshoz képest a teljes genom szekvenálás sokkal összetettebb alternatíva. Az elvégzendő szekvenálási reakciók száma sokkal nagyobb, ahogyan a generált nukleotidszekvencia-adatok száma is. A számítógépes elemzés jelentősen megnövekszik. Ezenkívül sokkal több genetikai változatot találunk, amint azt a 3. táblázat mutatja, ami megnehezíti a driver-gének azonosítását. A genomszekvenálás azonban teljes képet ad a betegben jelenlévő genetikai változásokról, beleértve a genom nagymértékű átrendeződéseit is. A genom közepes mélységű, rövid leolvasású szekvenálása azonban kihagyja a strukturális változásokat, különösen az alacsony komplexitású régiókban. Ezt az információt a 4. táblázat foglalja össze, amely az exom-szekvenálást más szekvenálási megközelítésekkel hasonlítja össze.
Amint korábban említettük, a fehérjekódoló gének a genomnak csak 3%-át teszik ki.16 A közelmúltig a genom többi részét “ömlesztett DNS-nek” tekintették, amely nem sok információértékkel bír. A legújabb tanulmányok azonban teljesen megváltoztatták ezt a nézőpontot. Egy nagy, az egész genomra kiterjedő projekt, az Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) projekt a genom összes régiójának funkcióját vizsgálja.31 A jelenleg rendelkezésre álló eredmények azt mutatják, hogy a genom több mint 70%-a átíródik. A keletkező átiratok közül sok nem fehérjéket kódol, de úgy tűnik, hogy szabályozó szerepet töltenek be a génexpresszióban. Ezek között vannak a már ismert miRNS-ek, amelyek az mRNS stabilitását és a transzlációt szabályozzák (1. ábra), de több mint 20 000 hosszú, nem kódoló RNS is, amelyek a transzkripciót szabályozzák. Emellett számos olyan DNS-régiót azonosítottak, amelyek a génexpressziót szabályozzák, köztük számos korábban ismeretlen promóter- és transzkripciószabályozó régiót (1. ábra). Ez az információ klinikai jelentőséggel bír, mivel a szabályozó régiókban bekövetkező mutációk befolyásolhatják bizonyos gének kifejeződését, és kóros következményekkel járhatnak. Valójában a genom-széles körű asszociációs vizsgálatok nagy része olyan DNS-régiókat hozott összefüggésbe kóros állapotokkal, amelyekben nem találtak fehérjekódoló mutációkat.32 Az ENCODE projektben keletkezett adatok lehetővé tették néhány eset felülvizsgálatát, amelyek azt találták, hogy a génexpressziót szabályozó régiókban található mutációk felelősek a betegségért.31,32 Egy nemrégiben készült példában Weedon és munkatársai33 arról is beszámoltak, hogy a PTF1A gén transzkripciót szabályozó régiójában található mutációk izolált hasnyálmirigy-agenezist okoznak. A szabályozó régiókban lévő mutációk nem mutathatók ki exomszekvenálással, mivel nem a kódolt fehérjét, hanem annak expresszióját befolyásolják. Ezért a teljes genom szekvenálás több információt nyújt, mint az exom szekvenálás, a megnövekedett komplexitás és a gazdasági költségek árán.
 |
4. táblázat A tömeges szekvenálási technikák összehasonlítása |
RNS-szekvenálás
Az RNS-szekvenálási technikák az RNS-populációk fordított átírással történő átalakításából komplementer DNS-é (cDNS) és az azt követő szekvenálásából állnak.34,35 Az mRNS-szekvenálás esetében a sejtvonalban vagy szövetmintában kifejeződő mRNS-ek teljes populációját (az úgynevezett transzkriptomot) átalakítják cDNS-vé és szekvenálják. Az mRNS-szekvenálás folyamata információt szolgáltat az elemzett mintában átíródó gének nukleotidszekvenciájáról, és ezáltal a megfelelő fehérjék aminosav-szekvenciájáról. Ezenkívül megbecsülhető az egyes mRNS-ekhez generált szekvenciák száma, amely arányos az egyes mRNS-ek gyakoriságával. Ezért a génexpressziós szintek meghatározhatók és összehasonlíthatók más mintákéval, beleértve az esetleges kontrollmintákat is (4. táblázat). Az mRNS-szekvenálás másik sajátos előnye, hogy lehetővé teszi az alternatív splicing-események vizsgálatát.36,37 Amint korábban említettük, az elsődleges transzkriptek gyakran többféle módon kerülnek feldolgozásra, így különböző exonokat tartalmazó mRNS-ek keletkeznek (1. ábra). Ezeket az mRNS-eket mRNS-szekvenálással lehet azonosítani, nem pedig exom- vagy genomszekvenálással, amely az átíródó DNS szekvenálását határozza meg, nem pedig az érett transzkriptét. Egyébként az mRNS és az exom szekvenálás hasonló információt szolgáltat a genom fehérjét kódoló régiójáról. A különbség az, hogy az exom-szekvenálás az összes gént tartalmazza, az mRNS-szekvenálás pedig az elemzett mintában kifejeződő génekre korlátozódik. Például egy nemrégiben végzett mRNS-szekvenálási vizsgálat 462 egyéntől származó limfoblasztoid sejtvonalakon a 20 078 emberi génből körülbelül 13 000 gén kódoló szekvenciáját határozta meg.38 Ebben a példában körülbelül 7 000 gént nem vizsgáltak, mivel azok nem fejeződtek ki a limfoblasztoid sejtvonalakban. Azokban az esetekben azonban, amikor az adott betegség által érintett sejttípus vagy szövet jól ismert, az mRNS-szekvenálás egyenértékű lenne az exom-szekvenálással a driver-mutációk tanulmányozására. Az mRNS-szekvenálás másik jellemzője, hogy lehetővé teszi az RNS-szerkesztés által létrehozott szekvencia-változások kimutatását.39 Számos mRNS-t úgy dolgoznak fel, hogy egyes nukleotidok megváltoznak, és leggyakrabban adenozinról inozinra történő változások jönnek létre. Ezek a változások az mRNS-szekvenálással kimutathatók, de hogy az RNS-szerkesztés által vagy genomiális variációk következményeként keletkeztek-e, nem lehet megállapítani, hacsak nem hasonlítják össze az mRNS- és a genomiális szekvenciákat.
A mRNS-expressziós szintek meghatározása bizonyos esetekben nagyon hasznos lehet, mivel egyes betegségeket egy vagy több gén deregulált expressziója okozhat. Az expressziós szintek változásai nagyon informatívak lehetnek a betegség genetikai eredetéről. Például egy vagy több gén expressziójának megváltozása egy betegnél a kifejeződésüket szabályozó mechanizmusok működési zavarára utalhat. Ez a működési zavar lehet a gén-transzkripciót szabályozó régiókban bekövetkezett mutációk következménye, amint azt a genomszekvenálásról szóló részben tárgyaltuk. Ez a transzkripciót szabályozó faktorok expressziójában vagy szerkezetében bekövetkező változásokra is visszavezethető.40 A génexpresszióban bekövetkező változások gyakran a génexpresszió szabályozásának epigenetikai mechanizmusaiban, például a DNS-metilációban bekövetkező változásokra vezethetők vissza, amelyeket a genom- vagy exomszekvenálással nem lehet kimutatni.41 A teljes genom metilációjának vizsgálatára a közelmúltban olyan módszereket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik ezen epigenetikai információk részletes vizsgálatát.42 A rák az egyik olyan betegség, amellyel kapcsolatban több vizsgálatot végeztek a génexpressziós szintekben. Egyre több esetben a gének vagy géncsoportok expressziójában bekövetkező változások összefüggnek a rák diagnózisával, prognózisával vagy a rákellenes gyógyszerekre adott válasz előrejelzésével.43 A génexpresszió ezen változásait biomarkerként használják. Számos ilyen vizsgálat elérhető a Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov) adatbázisán keresztül.
Az RNS-szekvenálási projekt egy speciális típusa a kis szabályozó RNS-ek (miRNS-ek) nukleotidszekvenciájának és expressziós szintjének meghatározására irányul. A kis RNS-ek más gének kifejeződését szabályozzák azáltal, hogy meghatározzák mRNS-ük stabilitását és/vagy transzlációját (1. ábra). A miRNS-kifejeződés mintázatának változásai ezért jelentős hatással lehetnek a sejtek és szövetek fehérje-kifejeződési profiljára. Protokollokat dolgoztak ki egy adott minta teljes miRNS-populációjának tisztítására és szekvenálására, valamint expressziós szintjük meghatározására.44 A legtöbb exonbefogási platform az ismert miRNS-kódoló régiók akár 80%-át is tartalmazza.21
Gének kiválasztott csoportjainak szekvenálása
Egyes betegségeket már olyan részletesen tanulmányoztak, hogy az érintett gének többsége ismert. Ez lehet a helyzet a mendeli öröklődési mintázatú betegségek esetében, amelyekben az összes vizsgált esetet számos ismert gén valamelyikének mutációja okozza. Másik példa erre néhány olyan ráktípus, amelyek túlnyomórészt néhány gén mutációjára vezethetők vissza. Ilyen esetekben a beteg mintájának jellemzésére a közvetlenebb megközelítés a korábban a betegség okozójaként azonosított gének szekvenciájának meghatározása lenne. A klasszikus megközelítés e gének összes exonjának felerősítése és az egyes gének nukleotidszekvenciájának meghatározása lenne. Az alternatív tömeges szekvenálási megközelítés az összes érintett feltételezett genomi régió tisztítása és nukleotidszekvenciájuk egyidejű meghatározása egyetlen futtatással.45-47 A jelölt DNS-régiók tisztítására általában két módszert használnak. Az első a polimeráz láncreakciókkal történő felerősítésük, amelyhez primerként specifikus oligonukleotidokat használnak. A második módszer a minta DNS-ének fragmentálásából és a releváns fragmentumok specifikus oligonukleotidokhoz való hibridizációval történő tisztításából áll, akár oldatban, akár szilárd hordozóra rögzítve, ahogyan azt korábban az exonok tisztítására már leírták.48 A kiválasztott régiók tartalmazhatnak fehérjéket kódoló exonokat és más DNS-régiókat is, például transzkripciós szabályozó régiókat. Ezek a régiók általában néhány száz génnek felelnek meg, ezért a keletkezett szekvenciaadatok elemzése sokkal egyszerűbb, mint más tömeges szekvenálási megközelítések esetében. A fő korlátot az jelenti, hogy ez egy hipotézisvezérelt megközelítés, amely nem teszi lehetővé a mutációk kimutatását olyan génekben, amelyek korábban nem kapcsolódtak a vizsgált betegséghez (4. táblázat).
Példák az exomszekvenálás klinikai felhasználására
Az exomszekvenálás leggyakoribb felhasználása valószínűleg a monogén betegségek diagnosztikájában történik. Több mint 3000 monogén rendellenességet írtak le, bár a legtöbbjük molekuláris genetikai okai még mindig ismeretlenek.1 Az exomszekvenálás felhasználható e mutációk azonosítására, amint azt Kuhlenbäumer és munkatársai1 egy nemrégiben megjelent áttekintésben tárgyalták. Az első vizsgálatok közül néhányban az exomszekvenálást olyan ismert betegségekért felelős genetikai mutációk azonosítására használták, mint a Kabuki,49 Schinzel-Giedion,50 Joubert,51 és a hyperphosphatasia mentális retardációs szindrómák,52 súlyos agyi malformációk,53 vagy az ismert amyotrófiás laterálszklerózis.54 Az exomszekvenálást használták a mentális retardáció egy sporadikus esetében előforduló új mutációk felfedezésére is.29 Ezenkívül ezt a technikát alkalmazták például a veleszületett klóros hasmenés,55 a gyulladásos bélbetegség,56 a Charcot-Marie-Tooth-kór,57 az újszülöttkori diabetes mellitus,58 vagy a Brown-Vialetto-van Laere-szindróma diagnosztizálására.59 A Worthey és munkatársai56 által közölt tanulmány az exomszekvenálás klinikai alkalmazásának releváns példája. Egy fiúgyermek Crohn-betegséghez hasonló betegséggel jelentkezett, amelynél az átfogó klinikai értékelés ellenére nem állítottak fel végleges diagnózist. A szerzők úgy döntöttek, hogy exomszekvenálást alkalmaznak az okozó mutáció(k) azonosítására. A szekvenciaadatok elemzése 16 124 variánst mutatott ki a betegnél. Az adatok szűrése a homozigozitásban, hemizigozitásban vagy összetett heterozigozitásban jelenlévő új variánsok figyelembevétele mellett, valamint a fehérjefunkciót károsítónak jósolt, erősen konzervált aminosavmaradványokat érintve lehetővé tette a szerzők számára, hogy kiválasszanak egy mutációt az X-linked inhibitor of apoptosis génben (XIAP). Funkcionális vizsgálatok bizonyították e mutáció jelentőségét a betegnél megfigyelt proinflammatorikus válaszban. E mutáció azonosítása alapján allogén hematopoetikus progenitor sejtek transzplantációját végezték el. Az exomszekvenálás tehát lehetővé tette egy eddig nem jellemzett mutáció azonosítását, hogy molekuláris diagnózist lehessen felállítani egy egyedi beteg esetében, egy új betegség keretei között, ami kezelési tervet eredményezett. Az exomszekvenálás felhasználását az új okozó mutációk felfedezésében és a diagnosztikában a közelmúltban áttekintették.60,61
A gyakori és összetett betegségek vizsgálatát is exomszekvenálással közelítették meg. Genom-szintű asszociációs vizsgálatok kimutatták, hogy egyes genetikai variánsok számos betegség kockázatát hordozzák. Jól jellemzett példák erre az apolipoprotein E az Alzheimer-kórban, a H komplement faktor a makuladegenerációban vagy a glükocerebrosidáz/leucinban gazdag ismétlődő kináz 2 a Parkinson-kórban.62-64 Az exomszekvenálás lehetséges felhasználását a komplex betegségek vizsgálatára már megvitatták.2,28 Az exom-szekvenálás ilyen vizsgálatokban való alkalmazásának egyik korlátja, hogy a fenotípushoz társuló variánsok többsége a fehérjekódoló régióktól távol helyezkedik el, ami a teljes genom szekvenálását jobb megközelítéssé tenné.32 E genetikai variánsok némelyike befolyásolhatja a génexpressziót szabályozó transzkripciós szabályozó régiók működését. Az ENCODE projekt31,65 az egész genomra kiterjedő elemzéseket végzett ezekről a szabályozó régiókról, és azt találták, hogy az 5. kromoszóma bizonyos régióiban (például) számos genetikai variáns a GATA2 transzkripciós faktor kötőhelye, amely erősen összefügg a Crohn-betegséggel és más gyulladásos betegségekkel.
A rák olyan betegségek, amelyeket több biológiai folyamat megváltozását eredményező genomiális változások felhalmozódása okoz.19 A korábban tárgyalt monogén genetikai elváltozásokkal ellentétben a rákot kiváltó mutációk többsége nincs jelen a beteg normális szövetében; e mutációk nagy része fehérjekódoló régiókban található, és exomszekvenálással kimutatható.19 A genetikai változások másik fontos csoportja azonban a nagy genomiális átrendeződések, például deléciók, inverziók vagy transzlokációk, amelyek exomszekvenálással nem mutathatók ki.66 E korlátozás ellenére az exomszekvenálást két általános stratégiát alkalmaznak a rák vezető génjeinek felfedezésére: a daganatok exomjának összehasonlítását az ugyanattól a betegtől származó egészséges szövetek exomjával; vagy több, nem rokon beteg exomjának összehasonlítását hasonló számú egészséges kontrollszövet exomjával.67-70 Jelenleg kiterjedt tanulmányok folynak, amelyekben rákos betegek és kontrollok nagy kohorszának exom- vagy genomszekvenálását végzik a rák összes vezető génjének azonosítása érdekében.19,71,72 Az 5000 rákos genom projekt az egyik példa,73 mivel célja az 50 leggyakoribb ráktípus genomjának szekvenálása. A rendelkezésre álló adatok már eddig is megadták a leggyakoribb rákos megbetegedések általános genomikai tájképét, amint azt Vogelstein és munkatársai áttekintették.3 Körülbelül 140 olyan gént azonosítottak, amelyek megváltoztatva elősegítik a tumorigenezist, és ez megtalálható a korábban említett COSMIC adatbázisban.3 Egy ilyen gén mutációjának kimutatása egy rákos minta exómjában fontos lépés lehet a beteg megfelelő diagnózisa és kezelése felé. A jelenlegi adatok a rák genomjának komplexitásáról is képet adnak.3 A gyakori szolid tumorok átlagosan 33-66 nem szilensen szomatikus mutációt mutatnak.3 Ez a szám több mint 200-ra nő a mutagén anyagok által indukált tumorokban, mint például a tüdőrák és a melanoma, sőt több mint 1000-re a DNS-javító mechanizmusokban vagy a DNS-polimeráz E-ben hiányos tumorokban.3 Ezzel szemben a folyékony és gyermekkori tumorok kevesebb mint tíz szomatikus mutációt mutatnak.3 A daganatok fontos jellemzője, hogy gyorsan fejlődnek és heterogénné válnak, így ugyanattól a betegtől származó, a kezelés mentén különböző régiókban vagy különböző időszakokban gyűjtött mintákban különböző mutációkat találhatunk, amint azt nemrégiben az exom-szekvenálás is kimutatta.74,75. Ennek a komplexitásnak az ellenére kialakulóban van néhány egységesítő koncepció, és az ismert rákos driver gének többsége részt vesz a sejtek túlélését, sejtsorsát és a genom fenntartását szabályozó 12 útvonal közül egyben vagy többben.3,19 Ebben a forgatókönyvben az exom szekvenálást kezdik használni a rák diagnosztizálására a driver mutációk azonosítása révén, például prosztatarákban.76
Az exom szekvenálás a rák kezelésében is hasznos lehet. Egyes génmutációk jelenléte érzékenységet vagy rezisztenciát okozhat egy adott gyógyszerrel szemben, amit farmakogenomikának neveztek el. Például a fehérje-tirozinkináz-gátlók alkalmazása az Abelson murine leukemia viral onkogén homológ 1 (ABL) vagy az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) fehérjéket túlreprezentáló rákos megbetegedésekben már évek óta ismert. Az exom- és genomszekvenálási megközelítések azonban sokkal több mutációs választ tárnak fel a kezelési asszociációkra (amint azt egy áttekintés kiemeli77). Tanulságos példa erre az NCI-60 sejtpanel exomjának közelmúltbeli közzététele.78 Ez a panel kilenc ráktípusból származó 60 jól jellemzett sejtvonalat tartalmaz, és biológiai és farmakológiai vizsgálatok széles körében használták.79 E sejtek exomjának nukleotidszekvenciáját határozták meg, hogy megállapítsák az egyes sejtekben mutálódott rákmeghajtó géneket. A szerzők a feltételezett új rákvezérgének listájának összeállítása mellett megvizsgálták az egyes sejtvonalak genotípusa és a korábban meghatározott, nagyszámú rákellenes szerre adott válasz közötti lehetséges összefüggést. Összefüggést találtak bizonyos génmutációk és a több gyógyszerre adott válasz között, ami rávilágított az exomszekvenálás lehetséges jelentőségére a személyre szabott kezelés kiválasztásában. Az exomszekvenálás a rákos hajlam előrejelzésére is használható. Néhány példát találhatunk egy nemrégiben megjelent áttekintésben, amelynek középpontjában a vastagbélrák áll, és a teljes genom szekvenálást használja.72
Az exomszekvenálás orvosi kihívásai
Az exomszekvenálás jelentős javulást ígér a betegek diagnózisában, prognózisában és személyre szabott kezelésében. E technológia széles körű alkalmazása azonban még számos fejlesztést igényel, valamint fontos etikai és orvosi megfontolások meghatározását, amint azt a közelmúltban megjelent áttekintések is tárgyalták.23,27,60,61,71,77 A technikai kihívások közé tartozik az exonok rögzítésének, szekvenálásának és összehangolásának hatékonyabb techniká fejlesztése, hogy a szekvenciában lévő összes exon teljes és egyenletes reprezentációját kapjuk. A patológiás variánsok gyors és pontos kimutatásához az adatelemző szoftvereszközök javítására is szükség van. A kiterjedt exomszekvenáláshoz speciális berendezések bevezetésére és a szekvenciák előállításához, valamint a kapott adatok elemzéséhez és értelmezéséhez megfelelő szakértelemmel rendelkező szakemberekből álló csoportok alkalmazására lesz szükség.
Az exomszekvenálás diagnosztikai célú felhasználásához technikai irányelvek és szabályozások bevezetésére is szükség lesz. Olyan paramétereket kell majd normalizálni, mint a szekvenálási mélység, az exonok lefedettsége, a nukleotid szekvenciaadatok minőségi metrikái vagy az összehangolás hívása. Az adatok tárolását is szabályozni kell.
Egy sor összetett etikai kérdés is felmerül. Az egyik fontos kérdés a betegnek nyújtandó információkkal kapcsolatos. Az exomszekvenálás olyan genetikai változásokat mutathat ki, amelyek nem kapcsolódnak a diagnosztizált betegséghez. Előfordulhat, hogy a beteg olyan genetikai variánsokat mutat, amelyek rizikófaktort jelentenek, vagy más betegségek okozói lehetnek. Milyen információkat kell visszajuttatni a betegnek? Milyen bizonyítékok szükségesek ahhoz, hogy egy genetikai variánst a betegséggel összefüggőnek tekintsünk? Az adatok tulajdonjoga, hozzáférhetősége és tárolása további lényeges kérdések. Meg kell-e őrizni a generált adatokat a páciens életében történő esetleges későbbi felhasználás céljából? Ezek és más etikai megfontolások valószínűleg jelentős vitákat fognak kiváltani80 , és széles körű vitát igényelnek ahhoz, hogy megállapodás szülessen a klinikai gyakorlatban alkalmazandó kritériumokról.
Következtetés
Az exomszekvenálás már most is hatékony eszköz a genetikai betegségek molekuláris alapjainak meghatározására. A genetikai elemzés mélysége kisebb, mint a teljes genom szekvenálásé, mivel a nem fehérjekódoló régiókban lévő genetikai változásokat nem detektálják. Az exomszekvenáláshoz szükséges szekvenciák és szekvencia-elemzések csökkentett száma azonban megfizethetőbbé teszi a klinikai gyakorlatban. Ezért valószínűleg az exomszekvenálás lesz a betegek kezdeti elemzésének technikája, legalábbis addig, amíg a teljes genom szekvenálás ára nem csökken, és a jelentős adatelemzési eljárás nem javul. Az exomszekvenálás klinikai gyakorlatban való alkalmazásának fontos korlátja, hogy a legtöbb várható genetikai variáns funkcionális jelentősége még ismeretlen. Ez a helyzet gyorsan változik, mivel egyre több betegséggel összefüggő genetikai variánst határoznak meg és tesznek hozzáférhetővé nyilvános adatbázisokban. Valószínűsíthető, hogy néhány éven belül a betegség kialakulásának kockázatával összefüggő genetikai variációk nagy része ismert lesz, pontos molekuláris diagnosztikával, a betegség alakulásának előrejelzésével és farmakológiai válasszal. A beteg exomjának, vagyis genomjának pontos ismerete ezután meghatározó tényező lesz az orvosi gyakorlatban.
Köszönet
Hálásan köszönöm Rosario Peronának és Juliette Siegfriednek (ServingEdit.com) a kézirat kritikai felülvizsgálatát.
Közzététel
A szerző nem jelent összeférhetetlenséget e munkával kapcsolatban.
|
Kuhlenbäumer G, Hullmann J, Appenzeller S. Novel genomic techniques open new avenues in the analysis of monogenic disorders. Hum Mutat. 2011;32(2):144-151. |
|
|
Kiezun A, Garimella K, Do R, et al. Exome sequencing and the genetic basis of complex traits. Nat Genet. 2012;44(6):623-630. |
|
|
Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA Jr, Kinzler KW. Rák genom tájképek. Science. 2013;339(6127):1546-1558. |
|
|
Kirwan M, Dokal I. Dyskeratosis congenita: a genetikai rendellenesség sok arca. Clin Genet. 2008;73(2):103-112. |
|
|
Walne AJ, Dokal I. Advances in the understanding of dyskeratosis congenita. Br J Haematol. 2009;145(2):164-172. |
|
|
Brady PD, Vermeesch JR. Genomikai mikrotérhálózatok: a technológia áttekintése. Prenat Diagn. 2012;32(4):336-343. |
|
|
Hehir-Kwa JY, Pfundt R, Veltman JA, de Leeuw N. Pathogenic or not? A kópiaszám-variánsok klinikai relevanciájának értékelése. Clin Genet. 2013;84(5):415-421. |
|
|
Simons A, Sikkema-Raddatz B, de Leeuw N, Konrad NC, Hastings RJ, Schoumans J. Genome-wide arrays in routine diagnostics of hematological malignancies. Hum Mutat. 2012;33(6):941-948. |
|
|
Metzker ML. Szekvenálási technológiák – a következő generáció. Nat Rev Genet. 2010;11(1):31-46. |
|
|
Sastre L. Az új DNS-szekvenálási technológiák ígéretes korszakot nyitnak a rákkutatás és -kezelés előtt. Clin Transl Oncol. 2011;13(5):301-306. |
|
|
Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. International Human Genome Sequencing Consortium. Az emberi genom kezdeti szekvenálása és elemzése. Nature. 2001;409(6822):860-921. |
|
|
Abecasis GR, Auton A, Brooks LD, et al. 1000 Genomes Project Consortium. A genetikai variáció integrált térképe 1092 emberi genomból. Nature. 2012;491(7422):56-65. |
|
|
Yang Y, Liu R, Xie H, et al. Advances in nanopore sequencing technology. J Nanosci Nanotechnol. 2013;13(7):4521-4538. |
|
|
Chen YS, Lee CH, Hung MY, Pan HA, Chiou JC, Huang GS. DNS-szekvenálás egy DNS-polimeráz elektromos vezetőképesség-mérésével. Nat Nanotechnol. 2013;8(6):452-458. |
|
|
Lu ZX, Jiang P, Xing Y. A pre-mRNS alternatív splicing genetikai variációja emberi populációkban. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012;3(4):581-592. |
|
|
Pruitt KD, Harrow J, Harte RA, et al. The consensus coding sequence (CCDS) project: Közös fehérjekódoló génkészlet azonosítása a humán és egér genomban. Genome Res. 2009;19(7):1316-1323. |
|
|
Harrow J, Frankish A, Gonzalez JM, et al. GENCODE: the reference human genome annotation for The ENCODE Project. Genome Res. 2012;22(9):1760-1774. |
|
|
Teer JK, Mullikin JC. Exom-szekvenálás: az édes pont a teljes genomok előtt. Hum Mol Genet. 2010;19(R2):R145-R151. |
|
|
Liu X, Wang J, Chen L. Whole-exome sequencing reveals recurrent somatic mutation networks in cancer. Cancer Lett. 2013;340(2):270-276. |
|
|
Parla JS, Iossifov I, Grabill I, Spector MS, Kramer M, McCombie WR. Az exome rögzítés összehasonlító elemzése. Genome Biol. 2011; 12(9):R97. |
|
|
Sulonen AM, Ellonen P, Almusa H, et al. Comparison of solution-based exome capture methods for next generation sequencing. Genome Biol. 2011;12(9):R94. |
|
|
Clark MJ, Chen R, Lam HY, et al. Performance comparison of exome DNA sequencing technologies. Nat Biotechnol. 2011;29(10):908-914. |
|
|
Gullapalli RR, Desai KV, Santana-Santos L, Kant JA, Becich MJ. Újgenerációs szekvenálás a klinikai orvoslásban: Kihívások és tanulságok a patológia és az orvosbiológiai informatika számára. J Pathol Inform. 2012;3:40. |
|
|
Samuels DC, Han L, Li J, et al. Finding the lost treasures in exome sequencing data. Trends Genet. 2013;29(10):593-599. |
|
|
Taneri B, Asilmaz E, Gaasterland T. Biomedical impact of splicing mutations revealed through exome sequencing. Mol Med. 2012;18:314-319. |
|
|
Fu W, O’Connor TD, Jun G, et al; NHLBI Exome Sequencing Project. 6515 exom elemzése feltárja a legtöbb emberi fehérjekódoló variáns friss eredetét. Nature. 2013;493(7431):216-220. |
|
|
Marian AJ. A teljes exom/genom szekvenálás felfedezéseinek orvosi alkalmazásával kapcsolatos kihívások. Trends Cardiovasc Med. 2012;22(8):219-223. |
|
|
Singleton AB. Exom szekvenálás: egy átalakító technológia. Lancet Neurol. 2011;10(10):942-946. |
|
|
Vissers LE, de Ligt J, Gilissen C, et al. A de novo paradigm for mental retardation. Nat Genet. 2010;42(12):1109-1112. |
|
|
Gonzalez-Perez A, Perez-Llamas C, Deu-Pons J, et al. IntOGen-mutations identifies cancer drivers across tumor types. Nat Methods. 2013;10(11):1081-1082. |
|
|
Bernstein BE, Birney E, Dunham I, Green ED, Gunter C, Snyder M; ENCODE Project Consortium. Az emberi genom DNS-elemeinek integrált enciklopédiája. Nature. 2012;489(7414):57-74. |
|
|
Hardison RC. Az egész genomra kiterjedő epigenetikai adatok megkönnyítik a betegségre való hajlamossági asszociációs vizsgálatok megértését. J Biol Chem. 2012;287(37):30932-30940. |
|
|
Weedon MN, Cebola I, Patch AM, et al. International Pancreatic Agenesis Consortium. Rezesszív mutációk egy disztális PTF1A enhancerben izolált hasnyálmirigy-agenezist okoznak. Nat Genet. 2014;46(1):61-64. |
|
|
Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a transcriptomics forradalmi eszköze. Nat Rev Genet. 2009;10(1):57-63. |
|
|
Mutz KO, Heilkenbrinker A, Lönne M, Walter JG, Stahl F. Transcriptome analysis using next-generation sequencing. Curr Opin Biotechnol. 2013;24(1):22-30. |
|
|
Hitzemann R, Bottomly D, Darakjian P, et al. Genes, behavior and next-generation RNA sequencing. Genes Brain Behav. 2013;12(1):1-12. |
|
|
Costa V, Aprile M, Esposito R, Ciccodicola A. RNA-Seq and human complex diseases: recent accomplishments and future perspectives. Eur J Hum Genet. 2013;21(2):134-142. |
|
|
Lappalainen T, Sammeth M, Friedländer MR, et al; Geuvadis Consortium; Geuvadis Consortium. A transzkriptom és a genom szekvenálása funkcionális variációt tár fel az emberben. Nature. 2013; 501(7468):506-511. |
|
|
Slotkin W, Nishikura K. Adenosine-to-inosine RNA editing and human disease. Genome Med. 2013;5:105. |
|
|
Lee TI, Young RA. Transzkripciós szabályozás és annak hibás szabályozása betegségekben. Cell. 2013;152(6):1237-1251. |
|
|
Suvà ML, Riggi N, Bernstein BE. Epigenetikai átprogramozás a rákban. Science. 2013;339(6127):1567-1570. |
|
|
Li P, Demirci F, Mahalingam G, Demirci C, Nakano M, Meyers BC. Integrált munkafolyamat a DNS-metilációs elemzéshez. J Genet Genomics. 2013;40(5):249-260. |
|
|
Chibon F. Cancer gene expression signatures – the rise and fall? Eur J Cancer. 2013;49:2000-2009. |
|
|
Dedeoğlu BG. Nagy áteresztőképességű megközelítések a mikroRNS-expresszió elemzéséhez. Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103. |
|
|
Ni T, Wu H, Song S, Jelley M, Zhu J. Selective gene amplification for high-throughput sequencing. Recent Pat DNA Gene Seq. 2009; 3(1):29-38. |
|
|
Barretina J, Caponigro G, Stransky N, et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 2012;483(7391):603-607. |
|
|
Garnett MJ, Edelman EJ, Heidorn SJ, et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 2012;483(7391):570-575. |
|
|
Hoischen A, Gilissen C, Arts P, et al. Massively parallel sequencing of ataxia genes after array-based enrichment. Hum Mutat. 2010;31(4):494-499. |
|
|
Ng SB, Bigham AW, Buckingham KJ, et al. Exome sequencing identifies MLL2 mutations as a cause of Kabuki syndrome. Nat Genet. 2010;42(9):790-793. |
|
|
Hoischen A, van Bon BW, Gilissen C, et al. De novo mutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedion syndrome. Nat Genet. 2010;42(6):483-485. |
|
|
Edvardson S, Shaag A, Zenvirt S, et al. Joubert szindróma 2 (JBTS2) askenázi zsidóknál TMEM216 mutációval társul. Am J Hum Genet. 2010;86(1):93-97. |
|
|
Krawitz PM, Schweiger MR, Rödelsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome. Nat Genet. 2010;42(10):827-829. |
|
|
Bilgüvar K, Oztürk AK, Louvi A, et al. Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations. Nature. 2010;467(7312):207-210. |
|
|
Johnson JO, Mandrioli J, Benatar M, et al. ITALSGEN Consortium. Az exom szekvenálás VCP mutációkat mutat ki a familiáris ALS okaként. Neuron. 2010;68(5):857-864. |
|
|
Choi M, Scholl UI, Ji W, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(45):19096-19101. |
|
|
Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, et al. Making a definitív diagnózis: a teljes exom szekvenálás sikeres klinikai alkalmazása egy kezelhetetlen gyulladásos bélbetegségben szenvedő gyermeknél. Genet Med. 2011;13(3):255-262. |
|
|
Montenegro G, Powell E, Huang J, et al. Exome sequencing allows for rapid gene identification in a Charcot-Marie-Tooth family. Ann Neurol. 2011;69(3):464-470. |
|
|
Bonnefond A, Durand E, Sand O, et al. Neonatal diabetes mellitus molekuláris diagnózisa a teljes exom következő generációs szekvenálásával. PLoS One. 2010;5(10):e13630. |
|
|
Johnson JO, Gibbs JR, Van Maldergem L, Houlden H, Singleton AB. Exom szekvenálás Brown-Vialetto-van Laere szindrómában. Am J Hum Genet. 2010;87(4):567-9; szerzői válasz 569. |
|
|
Bras JM, Singleton AB. Exomszekvenálás a Parkinson-kórban. Clin Genet. 2011;80(2):104-109. |
|
|
Topper S, Ober C, Das S. Exome sequencing and the genetics of intellectual disability. Clin Genet. 2011;80(2):117-126. |
|
|
Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ, et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families. Science. 1993;261(5123):921-923. |
|
|
Klein RJ, Zeiss C, Chew EY, et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 2005;308(5720):385-389. |
|
|
Tan EK. Egy gyakori genetikai kockázati variáns (LRRK2 Gly2385Arg) azonosítása a Parkinson-kórban. Ann Acad Med Singapore. 2006;35(11):840-842. |
|
|
Libioulle C, Louis E, Hansoul S, et al. Novel Crohn disease locus identified by genome-wide association maps to a gene desert on 5p13.1 and modulates expression of PTGER4. PLoS Genet. 2007;3(4):e58. |
|
|
Stephens PJ, Greenman CD, Fu B, et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell. 2011;144(1):27-40. |
|
|
Jones S, Zhang X, Parsons DW, et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses. Science. 2008;321(5897):1801-1806. |
|
|
Parsons DW, Jones S, Zhang X, et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science. 2008;321(5897):1807-1812. |
|
|
Timmermann B, Kerick M, Roehr C, et al. MSI és MSS vastagbélrák szomatikus mutációs profiljai teljes exom újgenerációs szekvenálással és bioinformatikai elemzéssel azonosítva. PLoS One. 2010;5(12):e15661. |
|
|
Varela I, Tarpey P, Raine K, et al. Exome sequencing identifies frequent mutation of the SWI/SNF complex gene PBRM1 in renal carcinoma. Nature. 2011;469(7331):539-542. |
|
|
Ku CS, Cooper DN, Roukos DH. A rák genomszekvenálás klinikai jelentősége. World J Gastroenterol. 2013;19(13):2011–2018. |
|
|
Kilpivaara O, Aaltonen LA. Diagnosztikus rákgenom-szekvenálás és a csíravonal-variánsok hozzájárulása. Science. 2013;339(6127):1559-1562. |
|
|
Hudson TJ, Anderson W, Artez A, et al; International Cancer Genome Consortium. A rákgenom-projektek nemzetközi hálózata. Nature. 2010;464(7291):993-998. |
|
|
Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 2012;366(10):883-892. |
|
|
Ren SC, Qu M, Sun YH. Az intratumorális heterogenitás vizsgálata egysejtes szekvenálással. Asian J Androl. 2013;15(6):729-734. |
|
|
Hieronymus H, Sawyers CL. A prosztatarák genomikai tájképének bejárása a diagnózistól a halálig. Nat Genet. 2012;44(6):613-614. |
|
|
McLeod HL. Rák farmakogenomika: korai ígéret, de összehangolt erőfeszítésekre van szükség. Science. 2013;339(6127):1563-1566. |
|
|
Abaan OD, Polley EC, Davis SR, et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 2013;73(14):4372-4382. |
|
|
Weinstein JN. Gyógyszerkutatás: Sejtvonalak harcolnak a rák ellen. Nature. 2012;483:544-545. |
|
|
Shahmirzadi L, Chao EC, Palmaer E, Parra MC, Tang S, Gonzalez KD. A betegek döntései a másodlagos leletek nyilvánosságra hozataláról az első 200, klinikai diagnosztikai exom-szekvenáláson átesett egyén körében. Genet Med. Epub 2013. október 10. |
|
|
Flicek P, Amode MR, Barrell D, et al. Ensembl 2011. Nucleic Acids Res. 2011;39:D800-D806. |
|
|
Pruitt KD, Tatusova T, Klimke W, Maglott DR. NCBI referencia szekvenciák: jelenlegi helyzet, politika és új kezdeményezések. Nucleic Acids Res. 2009;37:D32-D36. |