はじめに
数多くの病気には遺伝的基盤がある。 あるものは、コードする遺伝子の変異により、あるタンパク質が欠如したり機能不全に陥ったりする結果である。 ハンチントン病、サラセミア、その他約1,000の遺伝性希少疾患のようなメンデル遺伝の疾患がそうである1。単一の遺伝子の変異だけが原因ではないとしても、多くの疾患が遺伝的基盤を持ち、複合疾患の危険因子として同定されている遺伝的変異や多型の数が増加している2。 がんは、体細胞変異で起こるように、がんのリスクを高めるか（生殖細胞系列変異など）、がんを促進するか（がん遺伝子）、細胞増殖を制御する細胞機構を損なうか（抑制遺伝子）の一つ以上の遺伝子の変異によって起こる遺伝病です3
これらの疾患の遺伝子基盤を明らかにすることは、数年前までは労力がかかる困難なプロジェクトとされてきました。 これらのプロジェクトは、遺伝子関連研究によって病気の伝播に関与している可能性のあるゲノム領域を特定することから始まることが多い。1 通常、病気の伝播に大きく関係するゲノム領域を特定するためには、複数の罹患者を持つ大家族の解析が必要である。 一般に、この領域には複数の遺伝子が含まれており、優性遺伝の場合には、すべての罹患者に存在し、その健康な親族には存在しない遺伝子変異を同定する必要がある。 劣性遺伝の場合、変異は罹患者の両方の対立遺伝子に存在し、罹患していない親族の対立遺伝子のいずれか、またはすべてに存在しなければならない。
遺伝病の診断も、ほとんどの場合、同様に手間がかかった。 最良のシナリオでは、病気はたったひとつの遺伝子の突然変異に起因していることがあります。 その場合、診断にはその遺伝子の塩基配列だけを特定する必要がある。 一般的には、ポリメラーゼ連鎖反応によって遺伝子をいくつかの断片として増幅し、それぞれのヌクレオチド配列が決定される。 多くの場合、この病気は複数の遺伝子のいずれかの変異によって引き起こされることがあり、罹患した患者の病気の遺伝的起源を見つけるためには、それらの遺伝子すべてを増幅して塩基配列を決定する必要がある。 例えば、先天性角化不全症では、dkc、tert、terc、NOP10、NH2、TINF2のいずれかの遺伝子に変異が見つかる可能性があり、原因変異が特定されていない患者もいるため、影響を受ける遺伝子数はさらに多くなります4,5。各患者の分子診断には、これらの遺伝子すべての塩基配列を決定しなければならないのです。 3 分子診断には、これらの遺伝子の塩基配列を決定する必要があります。 現在、これは手間と費用がかかる作業であり、多くの患者集団に使用することはできません。 実際には、ある種の癌に罹患した患者の重要な割合で変異しているいくつかの遺伝子だけが、診断と治療のために配列決定されている。
ここ数年になってようやく、与えられたサンプル中の複数の配列変異を同時に検出する技術が開発されてきた。 その多くは、デオキシリボ核酸（DNA）マイクロアレイ技術に基づくものである。 ジェノタイピングアレイでは、特定の疾患に関連する変異を含むオリゴヌクレオチドがスライド上にスポットされている。 患者のDNAサンプルはスライドの上に加えられ、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドが特定される。 コピー数変異は、患者の DNA に重複または欠落している DNA 領域の存在を検出するように設計された DNA マイクロアレイを使用して分析することもできます7。
しかし、分子医学における大きな進歩は、患者のDNAの塩基配列を短時間かつ手頃な価格で決定することができる大規模な配列決定技術の最近の開発でした9,10。 これらは、第2世代シーケンシング、次世代シーケンシング、ディープシーケンシング、あるいは超並列シーケンシングと呼ばれている。 これらの装置を用いると、数千万個の塩基配列が2週間以内に決定される。 これらの新しいシークエンシングシステムの能力を示す例として、2001年に発表された最初のヒトゲノムの画期的なシークエンシング11には、23の研究所の協調作業が必要で、13年かかり、総コストが約30億米ドルであったことに注目してほしい。 6580>
現代の配列決定方法の利用可能性は、ヒトゲノム、個人間の変動、および疾患における遺伝子変異の同定に関する我々の知識の飛躍的な成長を生み出している。 例えば、これらの方法論は、異なる地理的・民族的起源を持つ約1,000人の完全な塩基配列を決定し、個人間の平均配列変異を決定し、最も頻繁な多型を特定することを目的とした、進行中の1000ゲノムプロジェクト12の基礎となっている＜6580＞＜7994＞大量配列決定技術は、現在速いペースで進化している。 より小型で高速な機械が開発され、新しい配列決定法が導入されている。 13,14 技術的な課題は別として、DNA配列決定の価格は着実に下がっており、1,000米ドルでヒトゲノム1個の配列を決定するという目標も、数年後には実現しそうである。 現在、ヒトゲノム全体の塩基配列を決定し、生成されたすべての塩基配列データを解析することは、複雑で高価、かつ時間がかかるため、多くの研究がゲノムのごく一部で行われています。 特に現在注目されているのは、ゲノムの中でもエクソームと呼ばれるタンパク質をコードする領域の塩基配列の決定です。 エクソームシーケンスは全ゲノムシーケンスよりもはるかに安価であり、この技術の可能性、利点、限界についてこのレビューで議論する。
エクソームとは何か？ほぼすべてのヒトタンパク質コード化遺伝子は不連続な構造を持っている。 タンパク質をコードする領域は、エクソンと呼ばれるいくつかの断片に分割されています。 図1に模式的に示すように、エクソンはタンパク質をコードしないDNA断片、すなわちイントロンによって連結されている。 遺伝子は、遺伝子に対して上流、下流、あるいは内部に存在するいくつかの制御領域の制御のもと、プロモーター領域から転写される。 転写により、エクソンとイントロンを含む一次転写産物が作られる。 その後、リボ核酸（RNA）スプライシングの過程でイントロンが削除され、エクソンが結合して、1つの連続したタンパク質コード領域のみを含む成熟メッセンジャーRNA（mRNA）が生成される。 最近の研究から、ほとんどの遺伝子の一次転写産物はいくつかの方法でスプライシングされ、代替スプライシングバリアントとして知られるエクソンの特定の組み合わせを含む様々な成熟mRNAを生成することが分かってきた（図1）。 15
ヒトゲノムの解析により、タンパク質をコードする遺伝子はDNAのわずか3%程度であり、16エクソンはゲノムの1%とさらに小さい割合であることが示された16。 ヒトゲノムは3.3×109塩基対（bp）からなり、20,078個のタンパクコード遺伝子が含まれている17。各遺伝子は平均8個のエクソンに分けられ、それぞれ約170bpの長さである。 各遺伝子は平均8個のエクソンに分かれ、それぞれ約170bpの長さである。エクソン全体は約3×107bpである。 しかし、すべてのエクソンの塩基配列を決定することにより、ゲノム全体の塩基配列決定と同様に、コードされているタンパク質のアミノ酸配列に関する情報が得られる。ただし、エクソームの塩基配列決定とデータ解析のセクションで述べるように、mRNAのスプライシングを変更する変異は例外である。 すべてのエクソンを配列決定するこのシステムは、エクソームシーケンスと名付けられ、すべてのヒトタンパク質のアミノ酸配列の変異を検出する有効な方法となっています18。 非常に顕著なサイズの違いにより、エクソームシーケンスはゲノムシーケンスよりもはるかに安価であり、これにより生成された配列データの計算および機能解析が容易になる。
  |
図1 遺伝子構造および発現の概略図 |
 |
表1 ヒトゲノムとエクソームの一般的特徴 |
エクソン捕捉技術
エクソン配列決定の最初にして最も重要なステップはエクソンを分離または捕捉することである。 利用される方法は、DNAハイブリダイゼーションに基づくものである。 ヒトゲノムの解析により、すべての遺伝子エクソンの同定が可能となり、それぞれに特異的なオリゴヌクレオチドプローブの設計が容易となった。 このプローブを用いて、DNAからエクソンを精製する19 。まず、DNAを500 bp以下の大きさに断片化する。 次に、このDNAをエクソン特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした断片を精製する。 ハイブリダイゼーションは、液相で行うことができる。 この場合、オリゴヌクレオチドは、DNA-オリゴヌクレチド複合体が非ハイブリダイゼーションDNAのバルクから分離できるように、標識される。 一般的な例では、オリゴヌクレオチドをビオチンと共有結合させ、ビオチン結合分子であるストレプトアビジンと磁気ビーズを結合させて、DNA-オリゴヌクレオチドハイブリッドを分離することができる。 エクソンを含まないDNA断片はストレプトアビジンビーズに結合しないので、数回の洗浄で効率よく除去できる。 ビーズに結合したエクソンを含む断片は、低イオン強度条件下でDNA-オリゴヌクレオチドハイブリッドを解離させた後に回収できる。
エクソンは、DNAマイクロアレイと同様に、エクソン特異的オリゴヌクレオチドがスポットされている固体支持体に結合することによっても単離されることができる。 この場合、断片化したDNAをオリゴヌクレオチドの上に広げ、ハイブリダイゼーションを可能にする。
液相ハイブリダイゼーションプロトコルを用いたエクソーム単離キットは、Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA), Roche NimbelGen, Inc.など、多くのメーカーが提供している。 (Madison, WI, USA)、Illumina, Inc. (San Diego, CA, USA)、Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)などのハイブリダイゼーションプロトコルを使用しています。 これらのキットは、ゲノムに存在するエクソンの90%以上を分離することができ、90%以上の特異性を持ち、価格はエクソームあたりおよそ150米ドルである。 複数の著者がこれらのエクソームキャプチャープラットフォームを比較しており20-22、Clarkら22がSureSelect Human All Exon 50 Mb (Agilent Technologies)、Roche NimbleGen, IncのSeqCap EZ Exome Library v2.0 および Illumina, Inc の TruSeq Exome Enrichmentキットを比較して得たデータを表2に要約している。 一部のキットは、タンパク質コード領域に加え、mRNAの非翻訳領域もカバーしており、microRNA（miRNA）結合部位などの制御領域の解析が可能である。 また、5′非翻訳領域を含むことで、近接したプロモーター領域の解析も可能である22 。さらに、ほとんどのキットがmiRNAコーディング領域の最大80％をカバーしている21 。 エキソン精製は重要なステップであることに留意する必要がある。 エクソンを100％回収することは困難であり、エクソンは単離されたエクソームにおいてしばしば失われたり、過小に表現されたりする。 例えば、ある患者のエクソンを解析する際に、精製中に10%のエクソンが失われた場合、この技術的エラーにより関連する変異を見逃す確率は約10%になる。 したがって、高効率のエクソンキャプチャープロセスの使用は、エクソームシーケンスにおいて極めて重要である。
 |
Table 2 3大エクソームキャプチャープロダクトの比較 |
エクソン配列決定およびデータ解析
エクソンを含む断片は、現在利用可能な大規模配列決定装置システムまたは技術のいずれかを使用して配列決定される。 序文で述べたように、これらのプラットフォームは、数百万個のDNA断片のヌクレオチド配列を同時に決定する。 エクソームシーケンスにおける各断片の配列の決定された長さは長くなく、典型的には35bpから100bpの間である。 しかし、DNAは最初にランダムに断片化されたため、個々のヌクレオチドは多くの重複する断片の中に存在することになる。 したがって、十分な数の配列が得られれば、たとえ短くても、複数のDNA断片において、すべての塩基が独立して配列決定されることになる。 各塩基の配列が決定される回数をカバレッジまたは配列決定深度と呼ぶ。 カバレッジは、生成される塩基配列の品質と信頼性に直接関係する。 一般に、エクソームシーケンスで信頼できる結果を得るためには、20×-30×のカバレッジが必要と考えられている59。この配列深度は、可能性のある配列変動が20～30種類のDNA断片で独立して配列決定されたことを意味する。 前述のように、何百万もの配列からデータが生成され、その解析には特殊で複雑なコンピュータプログラムと専門知識が必要となる。19,23 予備段階として、生成された配列の質の分析がある。 その前段階として、生成された配列の質の分析が行われる。様々な配列長における配列の読み取り精度、読み取りの平均長、およびその他のパラメータがテストされる。 品質が十分であれば、各配列を参照配列と比較する。参照配列は、通常、入手可能な最後のバージョンのヒトゲノム配列である。 通常、生成された配列の 80% 以上は参照ゲノムとアライメントすることができます22 。このステップでは、参照ゲノムに対する塩基配列のばらつきが多少あっても構いません。 22 このステップでは、参照ゲノムに対してわずかな塩基変異が許容される。解析の次のステップは、参照配列と本研究で得られたエクソーム配列の間の配列変異を同定することである。 これらの変異のその後の解析により、研究対象の医学的問題について望ましい情報が得られる可能性がある。
 |
図2 エクソームシーケンスデータ解析＜8790>注釈：。 エクソームの分離、配列決定、データ解析に必要なステップを模式的に表したものである。 このプロセスにより、疾患の起源に関与する遺伝子変異（ドライバー遺伝子）、あるいは疾患感受性、進化、薬剤反応に関連する遺伝子変異を同定することができる。 これらのデータは、診断や予後、遺伝カウンセリング、個別化治療の設計に役立つ貴重な情報である |
エクソームシーケンスでは、いくつかの種類の遺伝的変異を検出することができます。 最も頻繁に見つかる違いの1つは、あるヌクレオチドが別のヌクレオチドに変わることで、例えば、AからG（ATAコドンからATG）です。 これらの変異は一塩基変異（SNV）と呼ばれますが、集団における頻度が1％～5％より大きく、いかなる疾患のリスクにも強い影響がない場合は一塩基多型（SNP）と見なされます。 ほとんどのSNVは、両方の配列の変異が同じアミノ酸をコードしているため、サイレント（同義）であり、また、同義としても知られている（例えば、GCAからGCCへの変異は、両方ともアラニンのコドンであるため、GCCとなる）。 これらの多型のほとんどは、コードされたタンパク質に違いはなく、進化的に淘汰されることもなく、ヒトのエクソームで最も頻繁に見つかる変異の代表である。 例外は、スプライシング制御シグナルや転写制御部位に影響を与えるサイレント変異で、コードされるアミノ酸に変化がなくても、mRNAのスプライシングや発現を変化させるものがある。 また、ヌクレオチドの変異がコードされたタンパク質に影響を与える場合もあり、これらは非サイレント変異または非同義変異である。 これらの変化は、コードされたアミノ酸に変化をもたらし（例えば、GATからGAGはアスパラギン酸をグルタミン酸に変える）、ミスセンス変異と呼ばれる。 より劇的な変化は、ヌクレオチドの変異が翻訳停止コドンを作る場合（例えば、TGCからTGAはシステインコドンを停止コドンに変える）に生じ、これはナンセンス変異と呼ばれる。 また、タンパク質のコドンに影響を及ぼさなくても、エクソームシーケンスで検出されるタイプのSNVもある。 エクソンはDNAをランダムに断片化した後に選択されるため、隣接するイントロン配列や、非翻訳領域を捕捉した場合には遺伝子プロモーターなどの連続したDNA領域も含まれる可能性がある24。 例えば、影響を受けたイントロンは成熟mRNA中に保持されるかもしれないし、連続したエキソンはスプライシングされるかもしれない（エキソンスキッピング）。 これらの変化は成熟mRNAのヌクレオチド配列を変化させ、その結果、SNVの下流でコードされるタンパク質が変化します。 その場合、アミノ酸の小さな欠失または挿入が生じる。
原因変異の同定
検出された配列変異の機能的関連性は、次のデータ解析ステップで決定されなければならない。 たとえすべてのヒトが遺伝的観点からほぼ同一であるとしても、個人間のヌクレオチド配列の相違の数は相当なものである26。この不均質性は、個々の配列決定プロジェクトで得られたデータの解釈を複雑にしている。 個人の塩基配列の違いに関する一般的なデータを表3に示す。 全ゲノムを対象とした場合、1000ゲノムプロジェクトおよび小規模な全ゲノム配列決定プロジェクトで得られたデータによると、個人間の配列の相違の数は4×106と推定されている27。 27,28 これらの遺伝的変異のほとんどは、先に述べたようにサイレントである。個人間のサイレントでない配列差の数は10,000と推定されている。 これらの変異のほとんどは一般集団に存在し、何世代にもわたって伝達される。 29
エクソームシーケンスプロジェクトで得られたデータは、他の個体に存在し、したがって研究対象の疾患と関連しないすべてのSNPを識別するために頻繁にフィルタリングされている2、19、23。 考慮すべき注意点は、すべての大規模データベースには、比較的頻度の高い疾患を引き起こすことが証明されている変異が多数含まれていることである。 次の課題は、グローバル集団に存在しないSNVのうち、もしあるとすれば、どのSNVが研究対象の疾患の原因であるのかを判断することである（表3）。 これに対して、1つまたはいくつかの変化は、原因となる役割を持つ可能性があり、これらはドライバー変化と呼ばれます。 これらのドライバー変化を同定するために用いられる手法は、研究の特定の状況によって異なります。 メンデル型の遺伝パターンを持つ疾患では、疾患と完全に分離する遺伝子変異を見つけるために、通常、多くの罹患者と非罹患者を分析する必要があります。 この比較は、よく特徴付けられた血統を持つ大家族において、より有益な情報となる。 十分に大きな家系がない場合、多数の無関係な患者と対照者を比較することで、ドライバー遺伝子を同定することも可能である。 さらに、進化的保存性に基づいて変異したアミノ酸の重要性を予測し、タンパク質の構造と機能への影響を予測するインシリコアルゴリズムなど、疾患に関連する可能性のあるSNVを選択するための基準が用いられる。 6580>
 |
表3 個体間の配列変異のまとめ |
これらのタイプの研究のいくつかの例は、後のセクションで提供される予定である。 しかし、研究が進むにつれて、遺伝性疾患の原因となる遺伝子変異がより多く同定されるようになり、その結果、患者さんで変異した遺伝子のいくつかはすでに記述されているであろう可能性が高くなりました。 これらの変異遺伝子は、文献やOnline Mendelian Inheritance in Manデータベース（http://www.omim.org）などの専門データベースで見つけることができる。 6580>
がんは、おそらく遺伝的基盤を持つ病気の中で最も一般的なグループである。 30 癌のドライバー遺伝子は、Catalog of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC; http://cancer.sanger.ac.uk) や The Cancer Genome Atlas (http://cancergenome.nih.gov/) などのデータベースで調べることができる。 より詳細な例は、エクソームシーケンスの臨床利用の例で紹介する。
エクソームシーケンスと他の大規模シーケンサーとの比較
ゲノムシーケンス
はじめにで述べたように、ヒトゲノム全体のシーケンスはますます安価になってきている。 エクソームシーケンスと比較すると、全ゲノムシーケンスはより複雑な選択肢となります。 実施しなければならないシーケンス反応の数は、生成されるヌクレオチド配列データの数と同様に、はるかに多くなっています。 計算機による解析は大幅に増加します。 さらに、表3に示すように、より多くの遺伝子変異が見つかるため、ドライバー遺伝子の同定がより困難になる。 しかし、ゲノム配列決定により、大規模なゲノム再編成を含め、患者に存在する遺伝子変化の全体像を把握することができる。 しかし、中程度の深さのゲノムのショートリード配列決定では、特に低複雑度領域における構造的変異を見逃してしまう。 この情報は、エクソームシーケンスと他のシーケンサーを比較した表4にまとめられている
前述のように、タンパク質をコードする遺伝子はゲノムの3％を占めるに過ぎない16。 しかし、最近の研究によって、この視点は完全に変わりつつある。 ゲノムの全領域の機能を研究する大規模なプロジェクト、Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) プロジェクトが進行中です31。現在得られている成果では、ゲノムの70%以上が転写されていることが判明しています。 現在得られている結果では、ゲノムの70%以上が転写されている。生成された転写物の多くはタンパク質をコードしないが、遺伝子発現の調節の役割を担っているようである。 その中には、mRNAの安定性や翻訳を制御するmiRNAがすでに知られているが（図1）、転写を制御する2万以上のロングノンコーディングRNAも含まれている。 さらに、これまで知られていなかったプロモーターや転写調節領域を含む、遺伝子発現を制御する多くのDNA領域が同定されている（図1）。 制御領域の変異は特定の遺伝子の発現に影響を与え、病的な結果をもたらす可能性があるため、これらの情報は臨床的な意義がある。 実際、ゲノムワイド関連研究の多くは、タンパク質をコードする変異が見つかっていないDNA領域と病態を関連付けている32。ENCODEプロジェクトで得られたデータにより、遺伝子発現制御領域の変異が疾患の原因であるとされた症例が修正された31, 32。また最近の例では、Weedonら33がPTF1A遺伝子の転写制御領域の変異により孤立膵臓無形成症を引き起こすと報告している。 制御領域の変異は、コードされたタンパク質に影響を与えるのではなく、その発現に影響を与えるため、エクソームシーケンスでは検出することができない。 したがって、全ゲノムシーケンスは、複雑さと経済的コストを犠牲にして、エキソームシーケンスよりも多くの情報を提供する。
 |
Table 4 大量シーケンス技術の比較 |
RNA sequencing技術は、逆転写によるRNA集団の相補DNA（cDNA）への変換とその後の配列決定からなる34,35。 mRNA配列決定の場合、細胞株または組織サンプルで発現するmRNAの完全な集団（トランスクリプトームとして知られている）をcDNAに変換し、配列を決定します。 mRNAの塩基配列決定のプロセスでは、分析したサンプルで転写されている遺伝子の塩基配列に関する情報が得られ、したがって、対応するタンパク質のアミノ酸配列に関する情報も得られます。 また、各mRNAについて生成された配列の数を推定することができ、その存在量に比例する。 したがって、遺伝子の発現量を測定し、可能な限り対照試料を含む他の試料の発現量と比較することができる（表4）。 前述したように、一次転写産物はしばしば複数の方法で処理され、異なるエクソンを含む mRNA が生成されます (図 1)。 これらのmRNAは、成熟転写産物の配列ではなく、転写されるDNAの配列を決定するエクソームシーケンスやゲノムシーケンスではなく、mRNAシーケンスによって同定することが可能です。 その他、mRNAシーケンスとエクソームシーケンスでは、ゲノムのタンパク質コード領域について同様の情報を得ることができます。 違いは、エクソームシーケンスにはすべての遺伝子が含まれ、mRNAシーケンスは分析したサンプルで発現する遺伝子に限定されることです。 例えば、最近行われた462人のリンパ芽球様細胞株のmRNAシーケンス研究では、ヒト遺伝子20,078個のうち、約13,000個の遺伝子のコード化配列が決定された38。この例では、リンパ芽球様細胞株では発現しないため約7,000個の遺伝子は研究対象外であった。 しかし、疾患によって影響を受ける細胞型や組織がよく分かっている場合、mRNAシーケンシングはドライバー変異の研究においてエクソームシーケンシングと同等であると考えられる。 39 多くのmRNAは、いくつかのヌクレオチドが変化するように処理され、アデノシンからイノシンへの変化が最も頻繁に生成されます。 これらの変化はmRNAの配列決定によって検出されますが、それがRNA編集によって生じたものなのか、それともゲノムの変異の結果なのかは、mRNAとゲノムの両方の配列を比較しない限り判断することができません。
ある種の病気は、1つまたは複数の遺伝子の発現が制御されないことによって引き起こされることがあるため、mRNAの発現レベルを決定することは、特定のケースで非常に便利です。 発現レベルの変化は、疾患の遺伝的起源について非常に有益である。 例えば、患者における1つ以上の遺伝子の発現の変化は、その発現を制御するメカニズムの機能不全を示す可能性がある。 この機能障害は、ゲノム解読の項で述べたように、遺伝子転写調節領域における変異に起因する可能性がある。 遺伝子発現の変化は、DNAメチル化など、遺伝子発現制御のエピジェネティックな機構の変化によることが多く、これはゲノムやエクソームシーケンスでは検出できません41。 遺伝子や遺伝子群の発現の変化が、がんの診断や予後、抗がん剤への反応性の予測に関係するケースが増えてきています43。 これらの研究の多くは、Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov) データベースを通じて利用可能である。
特定のタイプのRNA配列決定プロジェクトは、小さな制御RNA (miRNA) の塩基配列と発現レベルを決定することを目的としている。 小分子RNAは、そのmRNAの安定性および／または翻訳を決定することにより、他の遺伝子の発現を制御します（図1）。 したがって、miRNAの発現パターンの変化は、細胞や組織のタンパク質発現プロファイルに著しい影響を与える可能性があります。 44 ほとんどのエクソンキャプチャープラットフォームには、既知のmiRNAコーディング領域の80%までが含まれている21
選択した遺伝子セットのシーケンス
疾患によっては、すでに詳しく研究されており、関与する遺伝子がほとんどわかっているものもある。 これは、メンデル型の遺伝パターンを持つ疾患で、研究されたすべての症例が、多数の既知の遺伝子のいずれかに変異があることに起因している場合である。 また、少数の遺伝子の変異が主な原因である癌もその一例である。 このような場合、患者さんのサンプルの特徴を把握するためのより直接的なアプローチは、疾患の原因として以前に同定された遺伝子の配列を決定することであろう。 古典的な方法は、これらの遺伝子のすべてのエクソンを増幅し、それぞれのヌクレオチド配列を決定することである。 45-47 候補となる DNA 領域の精製には、一般に 2 つの方法が用いられる。 1つは、プライマーとして特定のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応による増幅であり、もう1つは、プライマーとして特定のオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応による増幅である。 第二の方法は、サンプルのDNAを断片化し、溶液中または固体支持体に固定した特定のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって関連する断片を精製するもので、これは以前にエクソンの精製について説明したのと同じである48。 これらの領域は通常数百の遺伝子に対応しているため、生成された配列データの解析は他のマッシブシーケンスアプローチよりもはるかに容易である。 主な制限は、これが仮説駆動型のアプローチであるため、研究対象の疾患にこれまで関連していなかった遺伝子の変異を検出することができないことである（表4）。 3,000以上の単発性疾患が報告されているが、そのほとんどの分子遺伝学的原因はまだ不明である1。最近のレビューでKuhlenbäumerら1が論じたように、エクソームシーケンスはこれらの変異の特定に使用することが可能である。 最初の研究のいくつかでは、カブキ症候群49、Schinzel-Giedion症候群50、Joubert症候群51、高ホスファタージア精神遅滞症候群52、重症脳奇形53、あるいは身近な筋萎縮性側索硬化症などの身近な疾患の原因となる遺伝子変異を特定するためにエクソームシークエンシングが使用されています54。 さらに、この技術は、例えば、先天性塩化物下痢症55、炎症性腸疾患56、シャルコー・マリー・トゥース病57、新生児糖尿病58、ブラウン・ヴィアレット・ファン・レア症候群59の診断に用いられている。Worthey et al56が報告した研究は、エクソーム配列決定の臨床応用の関連例を示すものである。 ある男児がクローン病様疾患を呈し、包括的な臨床評価を受けたが確定診断がつかなかった。 著者らは、原因変異を特定するためにエクソームシーケンスアプローチを使用することを決定した。 配列データの解析により、この患者さんには16,124のバリアントが検出されました。 ホモ接合体、ヘミ接合体、複合ヘテロ接合体に存在する新規変異を考慮しながらデータをフィルタリングし、タンパク質機能に損傷を与えると予測される高度に保存されたアミノ酸残基に影響を与えた結果、著者らはX連鎖アポトーシス抑制遺伝子（XIAP）の変異を選択することができました。 機能研究の結果、この変異が患者に観察される炎症性反応と関連することが示された。 この変異の同定に基づき、同種造血前駆細胞の移植が行われた。 したがって、エクソームシーケンスにより、新規疾患の設定において、個々の患者の分子診断を行うために未特定の変異を同定することができ、その結果、管理計画を立てることができたのです。 新しい原因変異の発見や診断におけるエクソームシーケンスの利用は、最近レビューされている。60,61
一般的で複雑な疾患の研究も、エクソームシーケンスを通じてアプローチされている。 ゲノムワイド関連研究により、いくつかの遺伝子変異が多くの疾患のリスクをもたらすことが示されている。 よく知られた例としては，アルツハイマー病におけるアポリポタンパク質E，黄斑変性症における補体因子H，パーキンソン病におけるグルコセレブロシダーゼ／ロイシンリッチリピートキナーゼ2などがある62-64。 これらの研究でエクソームシーケンスを使用する際の限界の一つは、表現型に関連するバリアントのほとんどがタンパク質コード領域の遠位に存在することであり、全ゲノムシーケンスの方が良いアプローチである32。これらの遺伝子バリアントの中には、遺伝子発現を制御する転写調節領域の機能に影響を与えるものがある。 ENCODEプロジェクト31,65では、これらの制御領域のゲノムワイドな解析が行われ、例えば5番染色体の特定領域におけるいくつかの遺伝子変異は、クローン病やその他の炎症性疾患と強く関連する転写因子GATA2の結合部位であることが明らかにされた
がんは、ゲノム変化の蓄積により、複数の生体プロセスの変化を引き起こす疾患である19。 先に述べた単発性の遺伝子変化とは対照的に、ほとんどのがんドライバー変異は患者の正常組織には存在しない。これらの変異の大部分はタンパク質コード領域に存在し、エクソームシーケンスで検出することができる19。 しかし、遺伝子変化のもう一つの重要なグループは、エクソームシーケンスでは検出できない欠失、逆位、転座などの大きなゲノム再編成である。66 この限界にもかかわらず、エクソームシーケンスは、腫瘍と同一患者の健常組織のエクソームの比較、または多数の無関係な患者のエクソームと同数の健常対照者のエクソームの比較という二つの一般戦略を用いてがんドライバー遺伝子発見に適用されてきた67。-現在、すべてのがんドライバー遺伝子を同定するために、がん患者および対照群の大規模コホートのエクソームまたはゲノムの配列決定を伴う大規模な研究が実施されている19,71,72 5,000 cancer genomes projectはその一例であり73、最もよく見られる50種類のがんのゲノム配列を決定することを目的としている。 Vogelstein et al. 3 がレビューしているように、利用可能なデータから、より一般的ながんの一般的なゲノム景観がすでに得られています。約140の遺伝子が、変化すると腫瘍形成を促進することが確認されており、これは前述のCOSMICデータベースで見ることができます3。 3 一般的な固形がんでは、非サイレントの体細胞突然変異が平均33～66個認められます。この数は、肺がんやメラノーマなど変異原性物質によって誘導される腫瘍では200個以上、DNA修復機構やDNAポリメラーゼEが欠損した腫瘍では1,000個以上にまで増加します3。 腫瘍の重要な特徴は、進化が早く不均質であることで、最近エクソームシーケンスで示されたように、異なる地域や治療中の異なる時期に収集された同じ患者からのサンプルで異なる変異が見つかることがある74,75。 この複雑さにもかかわらず、いくつかの統一的な概念が生まれつつあり、既知のがんドライバー遺伝子のほとんどは、細胞の生存、細胞の運命、およびゲノムの維持を制御する12の経路のうちの1つ以上に参加している。76
このシナリオでは、ドライバー変異の特定を通じて、例えば前立腺がんにおいて、エクソームシーケンスががん診断に用いられ始めている。 いくつかの遺伝子変異の存在は、特定の薬剤に対する感受性または耐性を与えることができ、これはファーマコゲノミクスと名付けられた。 例えば、ABL（Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1）やEGFR（Epidermal growth factor receptor）タンパク質を過剰発現しているがんに対して、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤を使用することは数年前から知られている。 しかし、エクソームおよびゲノムシーケンスアプローチにより、治療関連に対するより多くの変異反応が明らかになりつつある（ある総説で強調されている77）。 このパネルは、9つの癌種からなる60のよく特徴づけられた細胞株を含み、幅広い生物学的および薬理学的研究に用いられている79。これらの細胞のエクソームの塩基配列は、それぞれの細胞で変異した癌ドライバー遺伝子を確定するために決定されたもので、参考になる例としては、NCI-60パネル細胞の最近の公表がある。 著者らは、推定される新規のがんドライバー遺伝子のリストを提供するだけでなく、各細胞株の遺伝子型と、多数の抗がん剤に対するこれまでに決定された反応との間の可能な相関関係を研究した。 その結果、特定の遺伝子変異と複数の薬剤に対する反応性の間に相関関係が認められ、個別化治療の選択においてエクソームシーケンスが重要である可能性が明らかになりました。 また、エクソームシーケンスは、がんの素因を予測するためにも用いることができます。 72
Medical challenges of exome sequencing
Exome sequencingは、患者の診断、予後、および個別化治療における著しい改善を約束するものである。 しかし、この技術の広範な応用には、最近のレビューで議論されているように、重要な倫理的・医学的配慮の定義と同様に、まだ多くの改良が必要である。 また、病的バリアントを迅速かつ正確に検出するためのデータ解析ソフトウェアツールの改良も必要である。 6580>
診断にエクソームシーケンスを使用するには、技術的なガイドラインや規制の導入も必要である。 シーケンスの深さ、エクソンカバレッジ、ヌクレオチド配列データの品質指標、またはアライメントコールなどのパラメータを正規化する必要がある。 6580>
また、多くの複雑な倫理的問題がある。 重要な問題は、患者に提供されるべき情報に関連するものである。 エクソームシーケンスでは、診断対象の疾患とは関係のない遺伝子変異が検出される可能性がある。 患者は、危険因子となる遺伝子変異を持つかもしれないし、他の疾患の原因となる遺伝子変異を持つかもしれない。 どのような情報を患者に返すべきでしょうか？ 遺伝子変異が疾患に関連していると考えるために必要な証拠とは何であろうか。 データの所有権、アクセス権、保存は他の関連する問題である。 作成されたデータは、患者が生きている間、将来使用する可能性があるため保管されるべきなのか？ 6580>
結論
エクソームシーケンスは、すでに遺伝性疾患の分子基盤を決定するために用いられる強力なツールである。 非タンパク質コード領域の遺伝子変異は検出されないため，全ゲノムシークエンスと比較すると，遺伝子解析の深さは劣る。 しかし、エクソームシーケンスに必要な配列数および配列解析の数が少ないため、臨床の現場ではより安価な手法として利用されています。 したがって、少なくとも全ゲノムシーケンスの価格が下がり、かなりのデータ解析手順が改善されるまでは、エクソームシーケンスが患者の初期解析に選択される技術になると思われる。 エクソームシーケンスを臨床に応用する際の重要な限界は、予想されるほとんどの遺伝子変異の機能的意義がまだ不明であることである。 この状況は急速に変化しており、疾病に関連する遺伝子変異が次々と決定され、公開データベースで利用できるようになってきている。 数年後には、病気にかかるリスクに関連する遺伝子変異のほとんどが明らかになり、正確な分子診断、病気の進行の予測、薬理学的反応などが可能になると思われる。 6580>
謝辞
原稿を厳しくチェックしてくれたRosario PeronaとJuliette Siegfried (ServingEdit.com) に感謝の意を表します。
情報公開
著者はこの仕事に関して利益相反はないと報告している。
|
Kuhlenbäumer G, Hullmann J, Appenzeller S. Novel genomic techniques open new avenues in the analysis of monogenic disorders.は、新しいゲノム技術によって単発性障害の分析に新しい道を開いた。 Hum Mutat. 2011;32(2):144-151. |
|
|
Kirwan M, Dokal I. Dyskeratosis congenita: a genetic disorder of many faces.日本学術振興会特別研究員（PD）。 Clin Genet. 2008;73(2):103-112. |
|
|
Walne AJ, Dokal I. Advances in the understanding of dyskeratosis congenita.先天角化不全症の理解と治療。 Br J Haematol. 2009;145(2):164-172. |
|
|
Brady PD, Vermeesch JR.による、先天性角化不全症に対する理解の進歩。 ゲノムマイクロアレイ：技術概要。 Prenat Diagn. 2012;32(4):336-343. |
|
|
Hehir-Kwa JY, Pfundt R, Veltman JA, de Leeuw N. Pathogenic or not? コピー数バリアントの臨床的関連性を評価する。 Clin Genet. 2013;84(5):415-421. |
|
|
Simons A, Sikkema-Raddatz B, de Leeuw N, Konrad NC, Hastings RJ, Schoumans J. Genome-wide arrays in routine diagnostics of hematological malignancies.Oncology. Hum Mutat. 2012;33(6):941-948. |
|
|
Metzker ML.Leezw、N.K.、K.N.、H.R.、S.R.、Schoumans J. シーケンシングテクノロジー-次世代。 Nat Rev Genet. 2010;11(1):31-46. |
|
|
Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. International Human Genome Sequencing Consortium.（国際ヒトゲノム解析コンソーシアム）。 ヒトゲノムの初期配列決定と解析。 ネイチャー. 2001;409(6822):860-921. |
|
|
Abecasis GR, Auton A, Brooks LD, et al.1000 Genomes Project Consortium.ヒトゲノム解析コンソーシアム。 1,092のヒトゲノムから得られた遺伝的変異の統合マップ。 Nature. 2012;491(7422):56-65. |
|
|
Yang Y, Liu R, Xie H, et al. Advances in nanopore sequencing technology. J Nanosci Nanotechnol. 2013;13(7):4521-4538. |
|
|
Chen YS, Lee CH, Hung MY, Pan HA, Chiou JC, Huang GS. DNAポリメラーゼの電気伝導度測定によるDNAシークエンス。 Nat Nanotechnol. 2013;8(6):452-458. |
|
|
Lu ZX, Jiang P, Xing Y. ヒト集団におけるプレmRNAのalternative splicingの遺伝的バリエーション。 Wiley Interdiscip Rev RNA. 2012;3(4):581-592. |
|
|
Pruitt KD, Harrow J, Harte RA, et al. The consensus coding sequence (CCDS) project.「コンセンサス コーディング シーケンス」。 ヒトとマウスのゲノムに共通するタンパク質コード遺伝子セットを特定する。 また、このプロジェクトは、「ヒトとマウスのゲノムに共通するタンパク質コード遺伝子の特定」を目的としています。 2012;22(9):1760-1774. |
|
|
Liu X, Wang J, Chen L. Whole-exome sequencing reveals recurrent somatic mutation networks in cancer.（全ゲノム配列決定が癌における体細胞突然変異の再発ネットワークを明らかにする）。 Cancer Lett. 2013;340(2):270-276. |
|
|
Parla JS, Iossifov I, Grabill I, Spector MS, Kramer M, McCombie WR.の各氏が執筆した論文です。 エクソームキャプチャーの比較分析。 Genome Biol. 2011; 12(9):R97. |
|
|
Sulonen AM, Ellonen P, Almusa H, et al. 次世代シーケンサーのための溶液ベースのエキソームキャプチャー法の比較。 また、このような研究成果を踏まえて、「ゲノムバイオロジー研究会」を発足させ、「ゲノムバイオロジー研究会」の活動を展開しています。 Nat Biotechnol. 2011;29(10):908-914. |
|
|
Gullapalli RR, Desai KV, Santana-Santos L, Kant JA, Becich MJ.（英語）: “Performance comparison of exome DNA sequencing technologies.”（英語）: “Performance comparison of exome DNA sequencing technologies. 臨床医学における次世代シーケンサー。 臨床医学における次世代シーケンシング：病理学および生物医学インフォマティクスのための課題と教訓。 J Pathol Inform. 2012;3:40. |
|
|
Samuels DC, Han L, Li J, et al. Finding the lost treasures in exome sequencing data.「エクソームシーケンスデータで失われた宝物を見つける。 Trends Genet. 2013;29(10):593-599. |
|
|
Taneri B, Asilmaz E, Gaasterland T. Biomedical impact of splicing mutations revealed through exome sequencing.（英語サイト）. Mol Med. 2012;18:314-319. |
|
|
Fu W, O’Connor TD, Jun G, et al; NHLBI Exome Sequencing Project.「エクソームシーケンスプロジェクト」。 6,515のエクソーム解析により、ほとんどのヒトのタンパク質コード化バリアントの起源は最近のものであることが明らかになった。 Nature. 2013;493(7431):216-220. |
|
|
Marian AJ. 全エキソーム/ゲノム配列決定の発見を医療に応用する際の課題。 Trends Cardiovasc Med. 2012;22(8):219-223. |
|
|
Singleton AB.の項を参照。 エクソームシーケンス：変革のテクノロジー。 Lancet Neurol. 2011;10(10):942-946. |
|
|
Vissers LE, de Ligt J, Gilissen C, et al.A de novo paradigm for mental retardation.（知的障害に関するデノボパラダイム：デノボ）. Nat Genet. 2010;42(12):1109-1112. |
|
|
Gonzalez-Perez A, Perez-Llamas C, Deu-Pons J, et al. IntOGen-mutations identify cancer drivers across tumor types.は、腫瘍タイプに関係なく、癌ドライバーを特定する。 Nat Methods。 2013;10(11):1081-1082. |
|
|
Bernstein BE, Birney E, Dunham I, Green ED, Gunter C, Snyder M; ENCODE Project Consortium.によるものです。 ヒトゲノムの DNA エレメントの統合百科事典。 Nature. 2012;489(7414):57-74. |
|
|
Hardison RC.Nature（ネイチャー）。 ゲノムワイドなエピジェネティックデータは、疾患感受性関連研究の理解を促進する。 J Biol Chem. 2012;287(37):30932-30940. |
|
|
Weedon MN, Cebola I, Patch AM, et al.International Pancreatic Agenesis Consortium.膵臓奇形研究会. PTF1Aの遠位エンハンサーにおける劣性突然変異は、孤立性膵臓の先天性奇形を引き起こす。 Nat Genet. 2014;46(1):61-64. |
|
|
Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.邦訳は「トランスクリプトミクスの革命的ツール」。 Nat Rev Genet. 2009;10(1):57-63. |
|
|
Mutz KO, Heilkenbrinker A, Lönne M, Walter JG, Stahl F. 次世代シーケンサーによる転写産物解析(Transcriptome analysis using next-generation sequencing). Curr Opin Biotechnol. 2013;24(1):22-30. |
|
|
Hitzemann R, Bottomly D, Darakjian P, et al. Genes, behavior and next-generation RNA sequencing.「遺伝子と行動と次世代シーケンサー」。 Genes Brain Behav. 2013;12(1):1-12. |
|
|
Costa V, Aprile M, Esposito R, Ciccodicola A. RNA-Seq and human complex diseases: recent accomplishment and future perspectives.「RNA配列とヒト複合疾患：最近の業績と将来の展望」。 Eur J Hum Genet. 2013;21(2):134-142. |
|
|
Lappalainen T, Sammeth M, Friedländer MR, et al; Geuvadis Consortium; Geuvadis Consortium.は、ヒトの複雑な疾患に関する研究を行っています。 Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans（トランスクリプトームとゲノムの配列決定により、ヒトの機能的変異が明らかになった。 Nature. 2013; 501(7468):506-511. |
|
|
Slotkin W, Nishikura K. Adenosine-to-inosine RNA editing and human disease.「アデノシンからイノシンへのRNA編集と人間の病気」. Genome Med. 2013;5:105. |
|
|
Suvà ML、Riggi N、Bernstein BE.BE、Suvà ML、Riggi N、Bernstein BE.BE、Suvà ML、Riggi N、Bernstein BE. 癌におけるエピジェネティック・リプログラミング。 サイエンス. 2013;339(6127):1567-1570. |
|
|
Li P, Demirci F, Mahalingam G, Demirci C, Nakano M, Meyers BC.をご参照ください。 DNAメチル化解析のための統合ワークフロー。 J Genet Genomics. 2013;40(5):249-260. |
|
|
Chibon F. Cancer gene expression signatures – the rise and fall ? Eur J Cancer. 2013;49:2000-2009. |
|
|
Dedeoğlu BG. microRNA発現解析のためのハイスループット・アプローチ。 Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103. |
|
|
Ni T, Wu H, Song S, Jelley M, Zhu J. Selective gene amplification for high throughput sequencing.（邦訳：「高スループットシーケンスのための選択的遺伝子増幅」）。 最近のパットDNA Gene Seq。 2009; 3(1):29-38. |
|
|
Barretina J, Caponigro G, Stransky N, et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.（「癌細胞株百科辞典」は、癌の抗癌剤感受性に関する予測的モデリングを可能にする。 Nature. 2012;483(7391):603-607. |
|
|
Garnett MJ, Edelman EJ, Heidorn SJ, et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells.（「がん細胞の薬物感受性に関するゲノムマーカーの系統的同定」）。 Nature. 2012;483(7391):570-575. |
|
|
Hoischen A, Gilissen C, Arts P, et al. Massively parallel sequencing of ataxia genes after array-based enrichment.（英語）。 Hum Mutat. 2010;31(4):494-499. |
|
|
Hoischen A, van Bon BW, Gilissen C, et al. SETBP1のde novo変異はSchinzel-Giedion症候群の原因である。 Nat Genet. 2010;42(6):483-485. |
|
|
Edvardson S, Shaag A, Zenvirt S, et al. Ashkenazi JewsにおけるJoubert syndrome 2 (JBTS2) is associated with a TMEM216 mutation.アシュケナージユダヤにおけるSBTS2はTMEM216変異と関連している. Am J Hum Genet. 2010;86(1):93-97. |
|
|
Krawitz PM, Schweiger MR, Rödelsperger C, et al. Identity-by-descent filtering of exome sequence data identifies PIGV mutations in hyperphosphatasia mental retardation syndrome.エクソン配列データから特定したPIGV変異。 Nat Genet. 2010;42(10):827-829. |
|
|
Bilgüvar K, Oztürk AK, Louvi A, et al. Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations.All Rights Reserved.2010年9月30日。 Nature. 2010;467(7312):207-210. |
|
|
Johnson JO, Mandrioli J, Benatar M, et al.ITALSGEN Consortium.全ゲノム解析により、重篤な脳奇形における劣性WDR62変異を発見。 エクソームシーケンスにより、家族性ALSの原因としてVCP変異が明らかになった。 Neuron。 2010;68(5):857-864. |
|
|
Choi M, Scholl UI, Ji W, et al. 全エクソーム取得と超並列DNA配列決定による遺伝子診断(Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. また、このような場合にも、「医療費助成制度」を利用することができます。 Genet Med. 2011;13(3):255-262. |
|
|
Montenegro G, Powell E, Huang J, et al. Exome sequencing allows for rapid gene identification in a Charcot-Marie-Tooth family.（全ゲノム配列決定により、シャルコー・マリー・トゥースの家族の遺伝子を迅速に特定することが可能となる）。 Ann Neurol. 2011;69(3):464-470. |
|
|
Bonnefond A, Durand E, Sand O, et al. Molecular diagnosis of neonatal diabetes mellitus using next-generation sequencing of the whole exome.（Exome を使用した新生児糖尿病の分子診断）.2011;69(3):465-470.Bonnefond、Durand、Sand、et al. PLoS One. 2010;5(10):e13630. |
|
|
Johnson JO, Gibbs JR, Van Maldergem L, Houlden H, Singleton AB.の論文。 Brown-Vialetto-Van Laere症候群におけるエクソームシーケンス。 Am J Hum Genet. 2010;87(4):567-9; author reply 569. |
|
|
Bras JM、Singleton AB.Bras、Singleton AB. パーキンソン病におけるエクソームシークエンス。 Clin Genet. 2011;80(2):104-109. |
|
|
Topper S, Ober C, Das S. Exome sequencing and the genetics of intellectual disability.「知的障害におけるエキソームシーケンス」。 Clin Genet. 2011;80(2):117-126. |
|
|
Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ, et al. Apolipoprotein E type 4 alleleの遺伝子量と遅発性家族におけるアルツハイマー病リスク.The Gene dose of apolipoprotein E Type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families.The Genet. サイエンス。 1993;261(5123):921-923. |
|
|
Klein RJ, Zeiss C, Chew EY, et al. 加齢黄斑変性における補因子H多型。 サイエンス。 2005;308(5720):385-389. |
|
|
Tan EK. パーキンソン病における共通の遺伝子リスク変異（LRRK2 Gly2385Arg）の同定。 アン アカッド メッド シンガポール。 2006;35(11):840-842. |
|
|
Libioulle C, Louis E, Hansoul S, et al. Novel Crohn disease locus identified by genome-wide association maps to a gene desert on 5p13.1 and modulate expression of PTGER4.The Genome-wide Association. PLoS Genet. 2007;3(4):e58. |
|
|
Stephens PJ, Greenman CD, Fu B, et al. 大量のゲノム再配置は、癌発生中の単一の壊滅的イベントで獲得された。 Cell. 2011;144(1):27-40. |
|
|
Jones S, Zhang X, Parsons DW, et al. グローバルゲノム解析により明らかになったヒト膵臓癌における中核シグナル伝達パスウェイ。 Science. 2008;321(5897):1801-1806. |
|
|
Parsons DW, Jones S, Zhang X, et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme.（ヒト膠芽腫の統合ゲノム解析）。 Science. 2008;321(5897):1807-1812. |
|
|
Timmermann B, Kerick M, Roehr C, et al. MSIおよびMSS大腸がんの体細胞変異プロファイルは全エクソーム次世代シーケンスおよびバイオインフォーマティクス分析によって特定されました。 PLoS One. 2010;5(12):e15661. |
|
|
Varela I, Tarpey P, Raine K, et al. Exome sequencing identifies frequent mutation of the SWI/SNF complex gene PBRM1 in renal carcinoma.（「腎癌のエキソームシーケンスによる高頻度変異」の意）。 Nature. 2011;469(7331):539-542. |
|
|
Ku CS, Cooper DN, Roukos DH.によるもの。 がんゲノム解読の臨床的意義。 World J Gastroenterol. 2013;19(13):2011–2018. |
|
|
Kilpivaara O, Aaltonen LA. 診断用がんゲノムシークエンスと生殖細胞変異の寄与。 サイエンス. 2013;339(6127):1559-1562. |
|
|
Hudson TJ, Anderson W, Artez A, et al; International Cancer Genome Consortium.による診断用がんゲノムの開発。 がんゲノムプロジェクトの国際ネットワーク。 ネイチャー。 2010;464(7291):993-998. |
|
|
Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.「腫瘍内の不均一性と分岐進化は、マルチ領域配列決定によって明らかになった。 N Engl J Med. 2012;366(10):883-892. |
|
|
Ren SC, Qu M, Sun YH.（邦訳なし）。 シングルセルシーケンスによる腫瘍内不均一性の調査。 Asian J Androl. 2013;15(6):729-734. |
|
|
McLeod HL.M.S.A.（英文のみ）:Traversing genomic landscape from diagnosis and death. がんファーマコゲノミクス：初期の有望株、しかし協調的な努力が必要。 Science. 2013;339(6127):1563-1566. |
|
|
Abaan OD, Polley EC, Davis SR, et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology.「がん薬理学のためのゲノム資源：NCI-60パネルのエクソーム」。 Cancer Res. 2013;73(14):4372-4382. |
|
|
Weinstein JN. 創薬。 細胞株は癌と戦う。 ネイチャー。 2012;483:544-545. |
|
|
Shahmirzadi L, Chao EC, Palmaer E, Parra MC, Tang S, Gonzalez KD.（英語）: “Drug discovery: Cell lines battle cancer. 臨床診断用エクソームシーケンスを受けた最初の200人における二次所見の開示に関する患者の意思決定。 Genet Med. Epub October 10, 2013. |
|
|
Flicek P, Amode MR, Barrell D, et al.Ensembl 2011.日本学術振興会特別研究員奨励賞受賞。 Nucleic Acids Res. 2011;39:D800-D806. |
|
|
Pruitt KD, Tatusova T, Klimke W, Maglott DR.（ドイツ語）:Ensembl 2011. NCBI Reference Sequences: Current Status, Policy and New Initiatives. Nucleic Acids Res. 2009;37:D32-D36. |