Abstract
Ebben a dolgozatban több, kísérletekből kiválasztott tipikus szubsztrát, köztük arilaminok és arilhidrazinok acetilezési mechanizmusait vizsgáljuk a sűrűség funkcionális elmélet segítségével. Az eredmények azt mutatják, hogy az összes átmeneti állapotot négytagú gyűrűs szerkezet jellemzi, és a hidralazin (HDZ) a leghatásosabb szubsztrát. Az összes vegyület bioaktivitása a PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ sorrendben növekszik. A reakcióban kulcsszerepet játszik a konjunkciós hatás és az N atom magányos párjainak delokalizációja. Minden eredmény összhangban van a kísérleti adatokkal.
1. Bevezetés
Az arilamin N-acetiltranszferázok (NAT-ok, EC 2.3.1.5) a II. fázisú anyagcsere enzimek, amelyek prokariótákban és eukariótákban egyaránt megtalálhatók . Az N-acetilezési reakció az arilamin xenobiotikumok detoxifikációjához vezet, és végül az elektrofil arilnitréniumionokhoz irányul, amelyeket a DNS-adduktképződésért felelősnek tartanak . A két funkcionális NAT izoenzim, a NAT1 és a NAT2, a 81%-os aminosav szekvencia azonosság ellenére nagy különbségeket mutat a szubsztrátspecifikusság és a szöveti eloszlás tekintetében. Az utóbbi, a NAT2, túlnyomórészt a májban és a bélhámban fejeződik ki . Korábbi tanulmányok feltételezték, hogy a NAT-ok klasszikus ping-pong kinetikai mechanizmussal katalizálják az acetil-transzfert (1. séma). A humán NAT2 és a Salmonella typhimurium NAT (StNAT) hely-irányított mutagenezisének elemzése azt sugallta, hogy az acetilezési folyamat közvetítéséért egy cisztein-maradék felelős az aktív központban. A p-nitrofenil-acetáton (PNPA) és a NAT2-n nemrégiben végzett prestacionárius és állandósult állapotú kinetikai vizsgálatok kimutatták, hogy a NAT2 katalitikus mechanizmusa egy tiolát-imidazolium pár kialakulásától függhet. Bár az enzim eukariótákban és prokariótákban egyaránt megtalálható, a NAT-ok endogén szerepe még mindig nem világos . A szubsztrátmeghatározás kimutatta, hogy mind az arilaminok, mind az arilhidrazinok acetilálhatók a NAT-ok által . Az acetilátviteli reakció szükséges lépései az acetilcsoport átviteléből állnak az aktív centrum ciszteinmaradványáról a szubsztrátra, és egy proton eltávolításából az utóbbiról az előbbire. A dolgozatban részletes elméleti tanulmányt közlünk az arilaminok és arilhidrazin szubsztrátok acetilezésben való viselkedéséről, beleértve a szerkezetük tulajdonságait, az átmeneti állapotokat, az energiák profiljait.
2. Módszerek
Minden számítást a Gaussian03 programcsomagban implementált B3LYP sűrűségfunkcionál elmélet (DFT) módszerrel végeztünk , amelyet korábban már számos enzimatikus rendszeren sikeresen alkalmaztunk. A 6-31G* és 6-311+G (3df, 2p) báziskészletek használatakor a B3LYP hibrid funkcionált részesítettük előnyben a Hartree-Fock (HF) és MP2 módszerekkel szemben. Bár néha kudarcot vall a diszperzióban gazdag kölcsönhatások kezelésében, a B3LYP-módszert sikeresen alkalmazták számos biológiai rendszerre .
Az összes reaktáns, köztitermék és termék geometriáját a B3LYP/6-31G* elméleti szinten optimalizálták. Kitalálták a legstabilabb konformációkat, valamint energiáikat minden egyensúlyi és átmeneti állapotban. Az összes kapott stacionárius pontra frekvencia számításokat végeztünk, és minden átmeneti állapotnak csak egy képzeletbeli frekvenciája van. Továbbá az MP2/6-311+G** módszert alkalmazzuk a stacionárius pontok optimalizált struktúráin, hogy pontosabb energiaprofilokat kapjunk. Ha nincs külön kiemelve, az összes alábbi energiaelemzés az MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d) számítások eredményeire vonatkozik.
3. Eredmények és megbeszélés
3.1. Eredmények és megbeszélés
3.1. Eredmények és megbeszélés. A szubsztrátok határterületei
Hat szubsztrátot, p-aminobenzoesav(PABA), 4-metoxilánilin(4-MA), 4-aminosalicilát (4-AS), 5-aminosalicilát(5-AS), izoniazid(INZ), hidralazin (HDZ), választottunk ki a referenciák alapján , amelyek két különböző családba oszthatók: arilaminok és arilhidrazinok. Az 1. táblázatban mind a hat szubsztrát határobitális energiái (beleértve a HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 és LUMO+2) szerepelnek, amelyek a bioenzimatikus rendszerekben fontos szerepet játszanak . Az arilaminok esetében a HOMO-energiák a 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS sorrendben csökkennek, ami nukleofil reaktivitásuk növekedését jelzi. A hat szubsztrát közül (lásd a kiegészítő anyagok 1. ábráját, amely online elérhető a doi: 10.1155/2009/783035 oldalon) az INZ rendelkezik a legnagyobb energiahézaggal a HOMO és a LUMO között, ami a stabilitására utal. A természetes populációelemzés (NPA) eredményei azt mutatták, hogy az arilaminok családjának aktív amino-N atomjai elektronegatívabbak, mint a hidrazincsoporté, ami elsősorban a konjugációs hatásnak köszönhető.
Noha a PABA és a 4-AS különböző helyettesítésekkel rendelkezik a hattagú gyűrű aminocsoportjának p-helyén, bioaktivitásuk közel azonos. Egy intermolekuláris H-kötés stabilizálja magát a szubsztrátot, az energiacsökkenés körülbelül 19-21 kJ/mol. Mind az 5-AS HOMO-, mind a LOMO-energiája magasabb, mint a 4-A𝑆sé, ami arra utal, hogy az előbbi reaktívabb, mint az utóbbi.
Az arilhidrazin szubsztrátumok esetében a hattagú gyűrű gerincén lévő N atomok magányos párja delokalizálódik az egész rendszeren, így növelve annak stabilitását. A HDZ 𝐸(𝐿-𝐻)értékei 0,0318 a.u. magasabbak, mint az INZ-é, ami az utóbbinál nagyobb reaktivitásra utal.
3.2. A különböző útvonalak és átmeneti állapotok
Az aktív centrum ciszteinmaradványával elvileg minden szubsztrát reagálhat összehangolt vagy lépcsőzetes úton. Az előbbihez az átmeneti állapotokban (lásd 1. és 2. ábra, con-ts) a H5 hidrogénnek a cisztein S1 atomjára történő összehangolt átadása és az N4 és C2 atomok közötti kötés kialakulása tapasztalható. A régi kötések (N4H5 és S1C2) felszakadása és az újak (C2N4 és S1H5) kialakulása egyszerre történik. A reaktánsokat és a céltermékeket a potenciális energiafelületen (PES) egyetlen átmeneti állapot köti össze. Az összes átmeneti állapot fő szerkezeti adatait a kiegészítő anyagok 1. táblázata tartalmazza. A lépcsőzetes mechanizmus esetében a H5 atom először a karbonilcsoport O3 atomjára kerül át, ami az stw-ts1 átmeneti állapoton keresztül az N4 és a C2 atom között új kötés létrehozására törekszik. Ezután egy tioészter intermedier (intmed) jön létre. Következésképpen a H5 második vándorlása a hidroxilcsoportról az S1 atomra történik az stw-ts2-n keresztül az S1-C2 kötés felszakadásával együtt, ami végül a termékekhez vezet.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Az eredmények azt mutatják, hogy az összes átmeneti állapotot négytagú, közel síkbeli gyűrűszerkezet jellemzi. Minden átmeneti állapotban van két kis, 80°-nál kisebb szög (C2S1H5 és S1C2N4 a con-ts, C2O3H5 és C2N4H5 az stp-ts1, C2S1H5 és S1C2O3 az stp-ts2 esetében), amelyek nagy feszültséget hoznak az egész rendszerre és instabillá teszik azt. Az összes szubsztrát hat összehangolt átmeneti állapota (con-ts) közül a C2N4, N4H5 és S1H5 kötés tulajdonságai nagyjából azonosak az összes szubsztrát esetében, míg az S1 és C2 közötti kölcsönhatás az egyik meghatározó tényező az összehangolt lépésben.
A lépcsőzetes útvonalak esetében másképp alakulnak a dolgok. A C2 atom hibridizációs változásai hasonló tendenciát követnek (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) minden szubsztrát esetében a lépésenkénti acetilezés során (1. kiegészítő táblázat). A H5 első vándorlása az stp-ts1 átmeneti állapotba vezet, majd egy intmed nevű köztes állapot helyezkedik el a potenciális energiafelületen (PES), amely egy lokális minimum. Ez egy tetraéderes tiolester intermedier, ahogyan azt a korábbi kísérleti tanulmányokban javasolták . Rövid életű, és az stp-ts2 átmeneti állapoton keresztül hamarosan következik be a H5 átadás. A lépcsőzetes útvonal esetében a különböző szubsztrátokra vonatkozó vonulási állapotok szerkezete nagyon kevéssé különbözik a többitől. Az átmeneti állapotok 3D szerkezeteit a PABA esetében soroltuk fel (2. ábra), a többiek hasonlóak voltak azokhoz.
3.3 . Az energiák
A hat szubsztrát esetében az összes lehetséges útvonal relatív energiáit a nullának vett reaktánsok energiaösszegéből kiindulva végeztük el (3. ábra). A 3. ábrából megállapítható, hogy az összehangolt útvonalak előnyben vannak a lépésenkénti útvonalakkal szemben. Az összehangolt átmeneti állapotok (con-ts) energiahatárai 83,5 kJ/mol és 26,9 kJ/mol közötti tartományban alacsonyabbak, mint a lépésenkénti állapotoké (stp-ts1) (2. kiegészítő táblázat). Az arilhidrazinok jobb szubsztrátok, mint az arilaminok, és a HDZ a legreaktívabb a legalacsonyabb aktiválási energiával, ami jó egyezéssel megfelel a kísérleti adatoknak . Ezt a következtetést a szerkezetadatok elemzéséből is le lehetett vonni (1. kiegészítő táblázat). A fokozott konjunkciós hatás és a nitrogén magányos párok delokalizációja a gerincen stabilizálta az átmeneti állapotot. A PABA≈4-AS<4-MA<4-MA<5-AS≈INH<HDZ szekvenciában minden szubsztrát esetében megnövekedett a bioaktivitás.
4. Következtetések
A következő következtetéseket vonhatjuk le.
(i)Minden szubsztrát két különböző útvonalon keresztül acetilálható: az összehangolt és a lépcsőzetes úton, és az alacsonyabb aktiválási energiák miatt az előbbi sokkal előnyösebb.(ii)Számításaink alapján az arilhidrazinok jobb szubsztrátok, mint az arilaminok, és a HDZ a legreaktívabb, a legalacsonyabb aktiválási energiával. A bioaktivitás minden szubsztrát esetében a PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ sorrendben növekszik, ami nagyon jól összhangban van a kísérleti eredményekkel . (iii)Az acetilezésben nagyon fontos szerepet játszik a konjunkciós hatás és a delokalizált magányos párok. A fokozott konjunkciós hatás és a magányos párok számának növekedése a hattagú gyűrűnél alacsonyabb energiahatárhoz vezet.
Köszönet
Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta (20603030, 20873074 és 10674114 számú).), a Kínai Tudományos és Technológiai Minisztérium 973-as projektje (sz. 2009CB930103), Shandong tartomány Természettudományi Alapítványa (sz. Q2008B07) és a Ludong Egyetem Kreatív Kutatócsoportokért Alapítványa (sz. 08-CXA001) támogatta.
Kiegészítő anyagok
A dolgozat terjedelmi korlátai miatt az összes arilamin és arilhidrazin szubsztrát 3D szerkezetét, az összes átmeneti állapot fő szerkezeti adatait és a különböző útvonalak relatív energiáit a kiegészítő anyagokban gyűjtöttük össze.
- Kiegészítő anyagok
.