Abstract

Ebben a dolgozatban több, kísérletekből kiválasztott tipikus szubsztrát, köztük arilaminok és arilhidrazinok acetilezési mechanizmusait vizsgáljuk a sűrűség funkcionális elmélet segítségével. Az eredmények azt mutatják, hogy az összes átmeneti állapotot négytagú gyűrűs szerkezet jellemzi, és a hidralazin (HDZ) a leghatásosabb szubsztrát. Az összes vegyület bioaktivitása a PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ sorrendben növekszik. A reakcióban kulcsszerepet játszik a konjunkciós hatás és az N atom magányos párjainak delokalizációja. Minden eredmény összhangban van a kísérleti adatokkal.

1. Bevezetés

Az arilamin N-acetiltranszferázok (NAT-ok, EC 2.3.1.5) a II. fázisú anyagcsere enzimek, amelyek prokariótákban és eukariótákban egyaránt megtalálhatók . Az N-acetilezési reakció az arilamin xenobiotikumok detoxifikációjához vezet, és végül az elektrofil arilnitréniumionokhoz irányul, amelyeket a DNS-adduktképződésért felelősnek tartanak . A két funkcionális NAT izoenzim, a NAT1 és a NAT2, a 81%-os aminosav szekvencia azonosság ellenére nagy különbségeket mutat a szubsztrátspecifikusság és a szöveti eloszlás tekintetében. Az utóbbi, a NAT2, túlnyomórészt a májban és a bélhámban fejeződik ki . Korábbi tanulmányok feltételezték, hogy a NAT-ok klasszikus ping-pong kinetikai mechanizmussal katalizálják az acetil-transzfert (1. séma). A humán NAT2 és a Salmonella typhimurium NAT (StNAT) hely-irányított mutagenezisének elemzése azt sugallta, hogy az acetilezési folyamat közvetítéséért egy cisztein-maradék felelős az aktív központban. A p-nitrofenil-acetáton (PNPA) és a NAT2-n nemrégiben végzett prestacionárius és állandósult állapotú kinetikai vizsgálatok kimutatták, hogy a NAT2 katalitikus mechanizmusa egy tiolát-imidazolium pár kialakulásától függhet. Bár az enzim eukariótákban és prokariótákban egyaránt megtalálható, a NAT-ok endogén szerepe még mindig nem világos . A szubsztrátmeghatározás kimutatta, hogy mind az arilaminok, mind az arilhidrazinok acetilálhatók a NAT-ok által . Az acetilátviteli reakció szükséges lépései az acetilcsoport átviteléből állnak az aktív centrum ciszteinmaradványáról a szubsztrátra, és egy proton eltávolításából az utóbbiról az előbbire. A dolgozatban részletes elméleti tanulmányt közlünk az arilaminok és arilhidrazin szubsztrátok acetilezésben való viselkedéséről, beleértve a szerkezetük tulajdonságait, az átmeneti állapotokat, az energiák profiljait.

1. séma
A NAT-okkal katalizált acetiltranszfer reakció.

2. Módszerek

Minden számítást a Gaussian03 programcsomagban implementált B3LYP sűrűségfunkcionál elmélet (DFT) módszerrel végeztünk , amelyet korábban már számos enzimatikus rendszeren sikeresen alkalmaztunk. A 6-31G* és 6-311+G (3df, 2p) báziskészletek használatakor a B3LYP hibrid funkcionált részesítettük előnyben a Hartree-Fock (HF) és MP2 módszerekkel szemben. Bár néha kudarcot vall a diszperzióban gazdag kölcsönhatások kezelésében, a B3LYP-módszert sikeresen alkalmazták számos biológiai rendszerre .

Az összes reaktáns, köztitermék és termék geometriáját a B3LYP/6-31G* elméleti szinten optimalizálták. Kitalálták a legstabilabb konformációkat, valamint energiáikat minden egyensúlyi és átmeneti állapotban. Az összes kapott stacionárius pontra frekvencia számításokat végeztünk, és minden átmeneti állapotnak csak egy képzeletbeli frekvenciája van. Továbbá az MP2/6-311+G** módszert alkalmazzuk a stacionárius pontok optimalizált struktúráin, hogy pontosabb energiaprofilokat kapjunk. Ha nincs külön kiemelve, az összes alábbi energiaelemzés az MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d) számítások eredményeire vonatkozik.

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. Eredmények és megbeszélés

3.1. Eredmények és megbeszélés. A szubsztrátok határterületei

Hat szubsztrátot, p-aminobenzoesav(PABA), 4-metoxilánilin(4-MA), 4-aminosalicilát (4-AS), 5-aminosalicilát(5-AS), izoniazid(INZ), hidralazin (HDZ), választottunk ki a referenciák alapján , amelyek két különböző családba oszthatók: arilaminok és arilhidrazinok. Az 1. táblázatban mind a hat szubsztrát határobitális energiái (beleértve a HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 és LUMO+2) szerepelnek, amelyek a bioenzimatikus rendszerekben fontos szerepet játszanak . Az arilaminok esetében a HOMO-energiák a 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS sorrendben csökkennek, ami nukleofil reaktivitásuk növekedését jelzi. A hat szubsztrát közül (lásd a kiegészítő anyagok 1. ábráját, amely online elérhető a doi: 10.1155/2009/783035 oldalon) az INZ rendelkezik a legnagyobb energiahézaggal a HOMO és a LUMO között, ami a stabilitására utal. A természetes populációelemzés (NPA) eredményei azt mutatták, hogy az arilaminok családjának aktív amino-N atomjai elektronegatívabbak, mint a hidrazincsoporté, ami elsősorban a konjugációs hatásnak köszönhető.

Noha a PABA és a 4-AS különböző helyettesítésekkel rendelkezik a hattagú gyűrű aminocsoportjának p-helyén, bioaktivitásuk közel azonos. Egy intermolekuláris H-kötés stabilizálja magát a szubsztrátot, az energiacsökkenés körülbelül 19-21 kJ/mol. Mind az 5-AS HOMO-, mind a LOMO-energiája magasabb, mint a 4-A𝑆sé, ami arra utal, hogy az előbbi reaktívabb, mint az utóbbi.

Az arilhidrazin szubsztrátumok esetében a hattagú gyűrű gerincén lévő N atomok magányos párja delokalizálódik az egész rendszeren, így növelve annak stabilitását. A HDZ 𝐸(𝐿-𝐻)értékei 0,0318 a.u. magasabbak, mint az INZ-é, ami az utóbbinál nagyobb reaktivitásra utal.

3.2. A különböző útvonalak és átmeneti állapotok

Az aktív centrum ciszteinmaradványával elvileg minden szubsztrát reagálhat összehangolt vagy lépcsőzetes úton. Az előbbihez az átmeneti állapotokban (lásd 1. és 2. ábra, con-ts) a H5 hidrogénnek a cisztein S1 atomjára történő összehangolt átadása és az N4 és C2 atomok közötti kötés kialakulása tapasztalható. A régi kötések (N4H5 és S1C2) felszakadása és az újak (C2N4 és S1H5) kialakulása egyszerre történik. A reaktánsokat és a céltermékeket a potenciális energiafelületen (PES) egyetlen átmeneti állapot köti össze. Az összes átmeneti állapot fő szerkezeti adatait a kiegészítő anyagok 1. táblázata tartalmazza. A lépcsőzetes mechanizmus esetében a H5 atom először a karbonilcsoport O3 atomjára kerül át, ami az stw-ts1 átmeneti állapoton keresztül az N4 és a C2 atom között új kötés létrehozására törekszik. Ezután egy tioészter intermedier (intmed) jön létre. Következésképpen a H5 második vándorlása a hidroxilcsoportról az S1 atomra történik az stw-ts2-n keresztül az S1-C2 kötés felszakadásával együtt, ami végül a termékekhez vezet.

1. ábra
Az arilamin N-acetiltranszferázok által katalizált reakció összehangolt és lépésenkénti útjai.


(a)

(b)

(c)

(d)


(a)
(b)
(c)
(d)

2. ábra
A PABA összehangolt és lépcsőzetes útjának átmeneti állapotainak szerkezete.

Az eredmények azt mutatják, hogy az összes átmeneti állapotot négytagú, közel síkbeli gyűrűszerkezet jellemzi. Minden átmeneti állapotban van két kis, 80°-nál kisebb szög (C2S1H5 és S1C2N4 a con-ts, C2O3H5 és C2N4H5 az stp-ts1, C2S1H5 és S1C2O3 az stp-ts2 esetében), amelyek nagy feszültséget hoznak az egész rendszerre és instabillá teszik azt. Az összes szubsztrát hat összehangolt átmeneti állapota (con-ts) közül a C2N4, N4H5 és S1H5 kötés tulajdonságai nagyjából azonosak az összes szubsztrát esetében, míg az S1 és C2 közötti kölcsönhatás az egyik meghatározó tényező az összehangolt lépésben.

A lépcsőzetes útvonalak esetében másképp alakulnak a dolgok. A C2 atom hibridizációs változásai hasonló tendenciát követnek (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) minden szubsztrát esetében a lépésenkénti acetilezés során (1. kiegészítő táblázat). A H5 első vándorlása az stp-ts1 átmeneti állapotba vezet, majd egy intmed nevű köztes állapot helyezkedik el a potenciális energiafelületen (PES), amely egy lokális minimum. Ez egy tetraéderes tiolester intermedier, ahogyan azt a korábbi kísérleti tanulmányokban javasolták . Rövid életű, és az stp-ts2 átmeneti állapoton keresztül hamarosan következik be a H5 átadás. A lépcsőzetes útvonal esetében a különböző szubsztrátokra vonatkozó vonulási állapotok szerkezete nagyon kevéssé különbözik a többitől. Az átmeneti állapotok 3D szerkezeteit a PABA esetében soroltuk fel (2. ábra), a többiek hasonlóak voltak azokhoz.

3.3 . Az energiák

A hat szubsztrát esetében az összes lehetséges útvonal relatív energiáit a nullának vett reaktánsok energiaösszegéből kiindulva végeztük el (3. ábra). A 3. ábrából megállapítható, hogy az összehangolt útvonalak előnyben vannak a lépésenkénti útvonalakkal szemben. Az összehangolt átmeneti állapotok (con-ts) energiahatárai 83,5 kJ/mol és 26,9 kJ/mol közötti tartományban alacsonyabbak, mint a lépésenkénti állapotoké (stp-ts1) (2. kiegészítő táblázat). Az arilhidrazinok jobb szubsztrátok, mint az arilaminok, és a HDZ a legreaktívabb a legalacsonyabb aktiválási energiával, ami jó egyezéssel megfelel a kísérleti adatoknak . Ezt a következtetést a szerkezetadatok elemzéséből is le lehetett vonni (1. kiegészítő táblázat). A fokozott konjunkciós hatás és a nitrogén magányos párok delokalizációja a gerincen stabilizálta az átmeneti állapotot. A PABA≈4-AS<4-MA<4-MA<5-AS≈INH<HDZ szekvenciában minden szubsztrát esetében megnövekedett a bioaktivitás.

3. ábra
Az összes szubsztrát energiaprofilja.

4. Következtetések

A következő következtetéseket vonhatjuk le.

(i)Minden szubsztrát két különböző útvonalon keresztül acetilálható: az összehangolt és a lépcsőzetes úton, és az alacsonyabb aktiválási energiák miatt az előbbi sokkal előnyösebb.(ii)Számításaink alapján az arilhidrazinok jobb szubsztrátok, mint az arilaminok, és a HDZ a legreaktívabb, a legalacsonyabb aktiválási energiával. A bioaktivitás minden szubsztrát esetében a PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ sorrendben növekszik, ami nagyon jól összhangban van a kísérleti eredményekkel . (iii)Az acetilezésben nagyon fontos szerepet játszik a konjunkciós hatás és a delokalizált magányos párok. A fokozott konjunkciós hatás és a magányos párok számának növekedése a hattagú gyűrűnél alacsonyabb energiahatárhoz vezet.

Köszönet

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta (20603030, 20873074 és 10674114 számú).), a Kínai Tudományos és Technológiai Minisztérium 973-as projektje (sz. 2009CB930103), Shandong tartomány Természettudományi Alapítványa (sz. Q2008B07) és a Ludong Egyetem Kreatív Kutatócsoportokért Alapítványa (sz. 08-CXA001) támogatta.

Kiegészítő anyagok

A dolgozat terjedelmi korlátai miatt az összes arilamin és arilhidrazin szubsztrát 3D szerkezetét, az összes átmeneti állapot fő szerkezeti adatait és a különböző útvonalak relatív energiáit a kiegészítő anyagokban gyűjtöttük össze.

  1. Kiegészítő anyagok

.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.