Abstract
アリールアミンやアリールヒドラジンなど、実験から選ばれたいくつかの典型的な基質のアセチル化機構を、密度汎関数理論を用いて検討した。 その結果，すべての遷移状態が4員環構造で特徴付けられ，ヒドラジン（HDZ）が最も強力な基質であることがわかった。 また、すべての化合物について、PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZという順序で生理活性が増加することがわかった。 この反応には、N原子の孤立対の連接効果と非局在化が重要な役割を果たす。 すべての結果は実験データと一致した。
1. はじめに
アリールアミンN-アセチルトランスフェラーゼ（NAT、EC 2.3.1.5）は原核生物と真核生物の両方に存在する第二相代謝酵素である。 N-アセチル化反応は、アリールアミン異性体の解毒につながり、最終的にDNA付加体形成の原因とされる求電子性アリールニトレニウムイオンへと導く。 ヒトの場合、2つの機能的なNATアイソザイム、NAT1とNAT2は、81％のアミノ酸配列の同一性にもかかわらず、基質特異性と組織分布に大きな相違がある。 後者のNAT2は、肝臓と腸管上皮に主に発現している。 これまでの研究では、NATは古典的なピンポン型の反応機構でアセチルの転移を触媒すると考えられていた（Scheme 1）。 ヒトのNAT2やSalmonella typhimurium NAT (StNAT)の部位特異的変異導入解析から、活性部位のシステイン残基がアセチル化過程を仲介していることが示唆されている。 最近、p-ニトロフェニルアセテート（PNPA）とNAT2に関する前定常状態および定常状態のカイネティクス研究により、NAT2の触媒機構はチオラート-イミダゾリウム対の形成に依存している可能性があることが明らかにされた。 NATは、真核生物と原核生物の両方に存在する酵素であるが、その内在的な役割はまだ不明である。 基質の決定により、アリールアミンとアリールヒドラジンの両方がNATによってアセチル化されることが明らかになった。 アセチル基転移反応に必要なステップは、活性部位のシステイン残基から基質へのアセチル基の転移と、基質から基質へのプロトン1個の除去から構成されています。 本稿では、アリールアミンおよびアリールヒドラジン基質のアセチル化反応における挙動について、その構造の特性、遷移状態、エネルギーのプロファイルを含む詳細な理論的研究を紹介する。
2. 計算方法
すべての計算は、以前から多くの酵素系で成功している Gaussian03 プログラムパッケージに実装されている密度汎関数理論 (DFT) B3LYP 法を使って行った。 6-31G* と 6-311+G (3df, 2p) を使用した場合、 B3LYP ハイブリッド関数が Hartree-Fock (HF) や MP2 法より優先されました。 B3LYP法は、分散を多く含む相互作用の取り扱いに失敗することもありますが、多くの生体系に適用され、成功しています。
すべての反応物、中間体、生成物の形状はB3LYP/6-31G*レベルの理論で最適化されています。 最も安定なコンフォーメーションと、各平衡状態および遷移状態におけるエネルギーが明らかにされた。 得られたすべての定常点に対して周波数計算が行われ、各遷移状態は1つの虚数周波数を持つだけである。 さらに、MP2/6-311+G**法を用いて、より正確なエネルギープロファイルを得ることができた。 特に断りのない限り、以下のエネルギー解析はすべてMP2/6-311+G**/B3LYP/6-31G (d) 計算による結果である。 結果と考察
3.1. 基質のフロンティアオビタル
p-aminobenzoic acid(PABA), 4-methoxylaniline(4-MA), 4-aminosalicylate(4-AS), 5-aminosalicylate(5-AS), isoniazid(INZ), hydralazine(HDZ), という6種類の基質が文献によって選ばれ、これらはアリールアミンとアリールヒドラジンの2種類のグループに分けられます。 表 1 に、生体酵素系で重要な役割を果たすと考えられる 6 種類の基質について、フロンティア帯電エネルギー（HOMO-2、HOMO-1、HOMO、LUMO、LUMO+1、LUMO+2 など）を示した。 アリールアミンでは，4-MA > 5-AS > PABA > 4-ASの順でHOMOエネルギーが減少しており，求核反応性が高まっていることがわかる。 また、INZは6種類の基質の中で最もHOMO-LUMO間のエネルギーギャップが大きく、安定であることが示唆された。 自然集団分析（NPA）の結果、アリールアミン族の活性アミノN原子はヒドラジン族よりも電気陰性であり、これは主に共役効果によるものであることがわかった。
PABAと4-ASは6員環のアミノ基のp-部位に異なる置換があるが、その生物活性はほぼ同じであった。 分子間H結合は約19-21kJ/molのエネルギー降下で基質そのものを安定化させる。 5-ASのHOMOエネルギーとLOMOエネルギーは4-A𝑆sのそれよりも高く、前者は後者よりも反応性が高いことが示唆された。
アリールヒドラジン基の場合、6員環の骨格にあるN原子の孤立対が系全体に非局在化し、安定性が向上することがわかった。 HDZの𝐸(𝐿-𝐻)値はINZの値より0.0318 a.u.高く、後者より高い反応性を持つことが示された。 異なる経路と遷移状態
原則的にすべての基質は活性部位システイン残基と協調的または段階的な経路で反応することが可能である。 前者の場合、遷移状態（図1、図2参照）では、水素H5がシステインのS1原子に協調的に移動し、N4原子とC2原子の間に結合が形成される。 古い結合（N4H5とS1C2）の切断と新しい結合（C2N4とS1H5）の形成が同時に行われるのである。 反応物と目的生成物はポテンシャルエネルギー曲面（PES）上の唯一の遷移状態によって結ばれている。 全ての遷移状態の主要な構造データを補足資料の表1に示す。 段階的な機構としては、まずH5原子がカルボニル基のO3原子に移動し、遷移状態stw-ts1を経てN4とC2原子の間に新たな結合が生成する傾向があります。 そして、チオレステロール中間体（intmed）が形成される。 その結果、S1-C2結合の切断とともに、水酸基からstw-ts2を介してS1原子へのH5の2回目の移動が起こり、最終的に生成物が導かれる。
(a)
(b)
(c)
(d)
(b)
(c)
(d)
その結果、すべての遷移状態はほぼ平面的な4員環構造であることがわかった。 どの遷移状態にも80°以下の小さな角が2つあり（con-tsはC2S1H5とS1C2N4，stp-ts1はC2O3H5とC2N4H5，stp-ts2はC2S1H5とS1C2O3），これが系全体に大きな歪みをもたらし不安定にさせていることがわかった。 すべての基質の6つの協奏遷移状態（con-ts）のうち、C2N4、N4H5、S1H5の結合の性質はどの基質もほぼ同じであり、S1とC2の相互作用は協奏ステップの決定要因の1つであることがわかった。
段階的経路の場合は事情が違ってくる。 C2原子のハイブリダイゼーションは段階的なアセチル化において全ての基質で同様の傾向（𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3）にある（表1補足参照）。 H5の最初の移動により遷移状態stp-ts1となり、ポテンシャルエネルギー面（PES）上にintmedという中間体が位置し、これが局所最小となる。 これは、以前の実験研究で提案された四面体チオレステル中間体である . この中間体は短寿命で、遷移状態stp-ts2を経由してすぐにH5の転移が起こります。 段階的経路の場合、異なる基質に対する牽引状態の構造は、他のものとほとんど差がない。 遷移状態の立体構造はPABAについて示したが（図2）、他のものはそれらと類似していた。 エネルギー
6つの基質について、反応物のエネルギー和を0として、すべての可能な経路の相対エネルギーを調べた（図3）。 図3から、協調的な経路が段階的な経路より有利であることがわかる。 また、協奏遷移状態（con-ts）のエネルギー障壁は、ステップワイズ遷移状態（stp-ts1）よりも低く、83.5 kJ/mol から 26.9 kJ/mol の範囲にあります（表2補足）。 アリールヒドラジンはアリールアミンよりも優れた基質であり、HDZは最も反応性が高く活性化エネルギーが低いため、実験データとよく一致した。 この結論は、構造データ解析（表1補足）からも導き出すことができた。 このことは、構造データ解析（表1補足）からも導き出された。連結効果の向上と、骨格における窒素の孤立対の非局在化により、遷移状態が安定化された。 PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ の配列では、すべての基質に対する生理活性が向上していることがわかる。
4.Conclusions
以下の結論を導き出すことができます。
(i)すべての基質は2つの異なる経路でアセチル化できる：協奏的と段階的で、活性化エネルギーが低いため前者がはるかに好ましい。 (ii)計算から、アリールヒドラジンはアリールアミンよりも良い基質で、HDZは活性化エネルギーが最も低く反応性に富むものであった。 また、すべての基質の生理活性は、PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZという順序で増加し、実験結果と非常によく一致した。 (3)アセチル化には、コンジャンクション効果と非局在化ローンペアが非常に重要な役割を担っている。 6員環ではコンジャンクション効果の増強とローンペアの数の増加がエネルギー障壁を下げることにつながる。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会（No.20603030, No.20873074, No.10674114中国科学技術部973プロジェクト（No.2009CB930103）、山東省自然科学基金（No.Q2008B07）、魯東大学創意研究グループ基金（No.08-CXA001）である。）
補足資料
本論文の長さの制限のため、すべてのアリールアミン、およびアリールヒドラジン基質の立体構造、すべての遷移状態の主要構造データ、異なる経路の相対エネルギーは補足資料にまとめた。