3.1.2 Azides
Azide wordt beschouwd als een van de meest geschikte groepen voor biorethogonale reacties en click chemistry doeleinden. In tegenstelling tot ketonen en aldehyden komen er nauwelijks aziden voor in biologische systemen. Aziden bezitten een hoge intrinsieke energie, maar geen natuurlijke reactiepartner (King en Wagner, 2014), hebben kleine afmetingen en neutrale totale lading, en tenslotte zijn ze kinetisch stabiel onder fysiologische omstandigheden.
De Staudinger ligatie (Staudinger en Hauser, 1921) lijkt een goede kandidaat voor bioconjugatiereacties met aziden. In deze reactie reageren aziden met trifenylfosfine reagentia die een elektrofiele val bevatten om een aza-ylide tussenproduct te produceren dat reageert met de elektrofiele ester carbonylgroep en een vijf-ledige ring vormt die hydrolyse ondergaat om een uiteindelijke stabiele amidebinding te genereren (Fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013; Staudinger en Hauser, 1921). Een nieuwe variant van deze reactie werd kort daarna beschreven (King en Wagner, 2014; Saxon en Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000), aangeduid als “traceless Staudinger ligation,” waarbij het uiteindelijke amidegebonden product wordt bevrijd van het fosfine-oxide-gedeelte.
Figuur 5.6. Voorbeelden van bioconjugatiereacties met aziden. (A) Staudinger ligatie; (B) koper-gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie; (C) stam-gestuurde azide-alkyne cycloadditie; (D) cycloadditie met oxanorbornadienen. UAA, onnatuurlijke aminozuren.
De Staudinger ligatie is gebruikt in een verscheidenheid van toepassingen. Bijvoorbeeld, Raines et al. toegepast deze reactie als cysteïne-vrij alternatief voor NCL voor peptide ligatie (Nilsson et al., 2001) en in combinatie met NCL in de assemblage van kunstmatige RNAase A (Nilsson et al., 2005). Daarnaast werd het gebruikt in andere toepassingen, zoals eiwitimmobilisatie op vaste drager voor in vitro en in vivo beeldvorming (Saxon en Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), biomoleculen labeling in vitro en in vivo (Saxon en Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), eiwitverrijking (Vocadlo et al., 2003) en detectie (Charron et al., 2009), alsmede (Lemieux et al., 2003) eiwitmodificatie.
Niettemin heeft de Staudinger ligatie enkele nadelen. Namelijk, de trage kinetiek (tweede-orde snelheidsconstante in het lage 10-3 M-1s-1 bereik) (Lin et al., 2005), de oxidatiestabiliteit van de fosfineverbindingen (noodzaak om relatief hoge concentraties van het fosfine-reagens te gebruiken), en het potentieel van fosfines kruisreactiviteit met disulfiden (Lang en Chin, 2014; King en Wagner, 2014).
Aziden kunnen reageren met alkynen in een Cu(I)-gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie (CuAAC) of 1,3-dipolaire cycloadditie (Fig. 5.6B), een van de meest standaard voorbeelden van klikchemiereacties (Rostovtsev et al, 2002; Tornøe et al., 2002). Deze reactie is van groot belang in de biologische wetenschappen vanwege de goede selectiviteit, de hoge opbrengst en de milde reactieomstandigheden (kamertemperatuur in diverse oplosmiddelen). Bovendien kunnen zowel aziden als alkynen in eiwitten worden ingebracht zonder de eiwitstructuur en -functie te beïnvloeden (Steen Redeker et al., 2013). Het azide en het alkyne kunnen zeer snel een stabiele 1,2,3-triazoolbinding vormen onder fysiologische omstandigheden, in aanwezigheid van Cu(I). Het mechanisme voorgesteld door Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) beschrijft eerst de introductie van het terminale alkyne in een koperacetylide en een daaropvolgende aanval van het azide (King en Wagner, 2014). Onlangs is dit mechanisme verder verfijnd en is een dicopper intermediair voorgesteld (Worrell et al., 2013). De belangrijkste nadelen van deze reactie zijn de Cu(I)-afhankelijke nevenreacties en de Cu(I)-cytotoxiciteit (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), die de toepassing vooral hebben beperkt voor labeling in de extracellulaire ruimte (King and Wagner, 2014). CuAAC is op grote schaal gebruikt in veel verschillende biologische studies, bijvoorbeeld om fosfolipiden te labelen voor hun beeldvorming in vivo (Jao et al., 2009) en in vitro (Neef en Schultz, 2009), om virus oppervlak remodeling (Steinmetz et al., 2009), om eiwitten te wijzigen/labelen in vitro en in vivo (Link en Tirrell, 2003; Ngo en Tirrell, 2011; Liu en Schultz, 2010; Deiters et al., 2003), om nucleïnezuren te labelen (Weisbrod en Marx, 2008), en affiniteit-gebaseerde probe profilering (Speers et al., 2003).
Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de koper-cytotoxiciteit te overwinnen. Namelijk, het gebruik van wateroplosbare liganden voor Cu(I) coördinatie, het gebruik van koper-chelaterende organische aziden, en de introductie van ring stam in de alkyne gedeelte. In het eerste geval coördineren de in water oplosbare liganden Cu(I) om een geactiveerde koperkatalysator te vormen die CuAAC bij lage micromolaire concentraties van het metaal kan bevorderen en tegelijkertijd de potentiële toxiciteit van Cu(I) kan verminderen (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo and Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). In het tweede geval wordt de effectieve Cu(I)-concentratie op de plaats van de reactie verhoogd door azide liganden te gebruiken die een intern koper-chelerend deel bevatten (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). De laatste strategie behelst het gebruik van alkynen, die geactiveerd zijn om te reageren met een verbeterde kinetiek in afwezigheid van katalysator. In dit verband verhoogt het gebruik van cyclooctyne-moleculen de reactiviteit als gevolg van het vrijkomen van ring-streng (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). De strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) (Fig. 5.6C) is een krachtig hulpmiddel geworden, niet alleen voor eiwit- en antilichaamlabeling, maar ook voor andere toepassingen zoals antilichaamvrije Western Blot analyse (Boutureira et al., 2015) omdat extra reagentia of toxische metalen die biomoleculen kunnen beschadigen, niet nodig zijn. Zo hebben Bertozzi et al. de toepasbaarheid ervan bewezen bij de modificatie van gezuiverde eiwitten (Baskin et al., 2007). In verdere experimenten werd de reactie met succes in vitro toegepast op fibroblastcellen (Baskin et al., 2007). Verder werd SPAAC gebruikt om tumoren in levende muizen in beeld te brengen met behulp van nanodeeltjes (Koo et al., 2012) en 18F PET waarbij de fluor aan zowel azide als cycloalkyne werd gebonden (Jeon et al., 2012). Andere toepassingsgebieden werden gevonden in virusmodificatie en DNA-labeling (Qiu et al., 2013). Echter, de complexe synthese van cyclooctynen en het feit dat hun verhoogde opdikking en hydrofobiciteit de eiwitstructuur en stabiliteit kan beïnvloeden (Kim et al, 2013), en hun verhoogde activering nevenreacties met natuurlijk voorkomende thiolen kan bevorderen, kunnen als nadelen worden beschouwd.
Electron-deficiënte sulfonylaziden kunnen ook reageren met geactiveerde alkenen (oxanorbornadiënenen of norbornenen) in een metaalvrije cycloadditie (Fig. 5.6D), vergelijkbaar met de SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Het product van azide-alkeen cycloaddities is echter een relatief onstabiele triazoline in tegenstelling tot de aromatische triazolen gevormd in de klassieke klik cycloadditie. Een oxanorbornadieen dat zowel gespannen als elektron-deficiënt is, werd gebruikt als dipolarofiel in een reactie met aziden (van Berkel et al., 2008). In dit geval reageert de gespannen dubbele binding in oxanorbornadieen met aziden om een intermediair triazoline te vormen dat spontaan een retro Diels-Alder reactie ondergaat, waarbij furaan vrijkomt, wat leidt tot stabiele 1,2,3- of 1,4,5-triazolen. Deze reactie werd gebruikt om selectief een oxanorbornadieen-gefunctionaliseerd eiwit en een azide-gemodificeerd cyclisch peptide in waterige buffers te bioconjugeren. Hoewel oxanorbornadiënen gemakkelijker te synthetiseren zijn dan hun cyclooctyne tegenhangers, is deze cycloadditie-reactie vrij traag en niet volledig chemoselectief ten opzichte van andere functionele groepen die in eiwitten worden aangetroffen, wat het wijdverbreide gebruik ervan kan hebben beperkt (Lang en Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).