Het P74-26 Major Capsid Protein maakt gebruik van unieke architecturale eigenschappen-lasso’s, ringen, en flappen-om de stabiliteit van de capsid te verbeteren. We observeren verhoogde hydrofobe interacties aan de subunit-subunit interfaces binnen de capsid. De hydrofobe interacties zijn naar schatting >2-voudiger voor P74-26 dan voor andere mesofiele homologe verbindingen (supplementaire tabellen 3 en 4). Deze waarneming kan gedeeltelijk de verhoogde thermostabiliteit van de P74-26 capsid verklaren, aangezien het hydrofobe effect bij hoge temperatuur in sterkte toeneemt32. Daarentegen zien we geen significante verandering in het aantal waterstofbruggen of zoutbruggen (supplementaire tabellen 3 en 4), andere interacties die zijn gezien om thermostabiliteit te verlenen voor sommige bolvormige eiwitten33,34,35,36.
We waren niet bijzonder verrast om verhoogde hydrofobe interacties in de P74-26 capsid te vinden. Talrijke studies van thermofiele bolvormige eiwitten tonen verhoogde hydrofobe krachten aan als een belangrijke bijdrage tot thermische stabiliteit33,37,38,39,40. Er zijn echter twee dingen die de P74-26 capsid een uniek modelsysteem maken: (1) hoge interne druk van strak verpakt DNA induceert mechanische stress in de capsid 7,8,27 en (2) het is een zelf-assemblerende structuur waarin inter-subunit architectuur en topologie speelt een belangrijke rol in de algehele stabiliteit. We kunnen deze principes afleiden door de structuur van P74-26 te vergelijken met die van talrijke mesofiele homologen.
We vinden dat de P74-26 capsid gestabiliseerd wordt door verscheidene lussen en extensies die topologische verbanden vormen tussen subeenheden. De unieke E-lus lasso hecht zich aan de G-lus en P-domein van een naburige MCP, die fungeren als een liftpost voor topologische binding van de lasso. Bovendien omringen de N- en C-armen, samen met de Dec-arm, volledig de β-strengen van de E-lus, een ander architectonisch element dat uniek is voor P74-26 (Fig. 5e). De E-lus is dus naar de basis toe geringd en naar de top toe gelast.
Een tweede lasso wordt gevormd door de N-arm, die zowel intra-capsomer als inter-capsomer interacties vormt. De N-arm bindt zich aan de E-lus van een naburig MCP binnen een capsomer via de bovenarmstreng, de onderarmhelix en de handregio (fig. 5a, c). Verder stabiliseren de elleboog, onderarm en hand capsomer-capsomer interacties door binding met DecP74-26 en een MCP-subeenheid die dwars op de tweevoudige/quasi-tweevoudige assen ligt (Fig. 6a, b). Hoewel de N-arm technisch gezien geen gesloten lus is, sluit P74-26 de lus effectief door gebruik te maken van de unieke S-lus om de positie van de onderarm en hand regio’s te fixeren (Fig. 6c). We vinden geen vergelijkbare N-arm lasso architectuur in mesofiele Caudovirussen31,41,42,43,44,45,46, wat suggereert dat deze architectuur belangrijk is voor het verbeteren van de capsid stabiliteit.
Hoewel lasso’s niet worden gevonden in andere Caudovirussen, bevatten de ver verwante herpesvirussen analoge lasso architectuur in de N-arm van de HK97 vouw47,48,49. Net als de N-arm van P74-26, de herpesvirus N-arm lasso’s zijn niet echt gesloten lussen. Ondanks deze schijnbare gelijkenis functioneren de herpesvirus lasso’s anders. Zij stabiliseren uitsluitend inter-capsomer interacties, terwijl de N-arm lasso van P74-26 zowel intra-capsomer als inter-capsomer interacties stabiliseert. Bovendien vertonen de pentons van herpesvirus capsiden geen lasso-interacties en zijn de interacties variabel binnen hexon subeenheden, terwijl P74-26 bijna identieke lasso-interacties heeft in zowel pentons als hexons. Deze observaties geven aan dat de lasso architectuur waarschijnlijk onafhankelijk is geëvolueerd en benadrukt de flexibiliteit van topologische stabilisatiemechanismen. Wij stellen de hypothese voorop dat de verlengbare arm-architectuur de evolutie van sterkere interacties binnen zelfassemblerende systemen zoals capsiden vergemakkelijkt. Deze open lussen kunnen gemakkelijk verbeterd worden door seriële single-residue uitbreiding. Misschien is dit gemak van evolutie de reden waarom verlengde arm lasso’s worden gevonden in zowel P74-26 als herpesvirussen. Deze verlengde lasso’s zijn vergelijkbaar met N- en C-terminale extensies die bij andere virussen assemblage bewerkstelligen (b.v. C-terminale extensies in SV40 capsidum manteleiwitten50). We verwachten dat dit soort verlengde lasso’s nuttig kunnen zijn voor de engineering van stabielere capsiden en andere zelf-assemblerende deeltjes.
Een ander voordeel van de lasso architectuur is dat het een minder verlengde conformatie kan aannemen. P74-26 MCP heeft twee lasso’s aan beide uiteinden van de HK97 vouw, die vermoedelijk beide aanwezig zijn in de veel kleinere procapside. Door gebruik te maken van deze lassostructuren kan P74-26 een hoge stabiliteit behouden, terwijl het conformationele flexibiliteit biedt om uit te breiden tijdens de maturatie. Wij stellen de hypothese voorop dat de lasso’s in de procapside minder langgerekt zijn; bij de uitzetting van de capside bereiken de lasso’s hun volledige extensie, waar ze op hun plaats vastklikken. De volledige uitrekking die in de rijpe capside wordt waargenomen, zou zorgen voor spanningsintegriteit, zoals we hieronder bespreken.
P74-26 gebruikt inter-geweven flappen om de inter-capsomer contacten topologisch te stabiliseren. De T-lus stabiliseert inter-capsomer interacties door in te voegen in een groef op het P-domein van een MCP-subeenheid in een naburige capsomer. Deze T-lus interacties worden gevonden rond de drievoudige/kwasi-drievoudige assen langs de binnenzijde van de capsid (Fig. 7b; Aanvullende Fig. 7b). Op dezelfde manier worden de inter-capsomer tweevoudige/quasi-tweevoudige interacties gestabiliseerd aan de buitenzijde van de capside door de interleaved rangschikking van de N-armen (Fig. 7c; Supplementary Fig. 7a). Deze overlappende structuren lijken op de overlappende rangschikking van flappen in de bovenkant van een bewegende doos. Op deze manier worden de buiten- en binnenzijde van de capsid gestabiliseerd door twee afzonderlijke interleaving flap interacties. Wij stellen voor dat de bewegende doos-afspraken die te zien zijn op symmetrie- en quasi-symmetrie-assen de capside sterk versterken tegen interne druk, omdat ze topologisch gezien moeilijk te verstoren zijn. Deze rangschikkingen zijn echter vermoedelijk ook een uitdaging om te assembleren, wat de belangrijke vraag oproept hoe de P74-26 capside assembleert met een interleaved architectuur.
Het P74-26 Decoratie-eiwit neemt eveneens een unieke structurele rangschikking aan, die aanzienlijk bijdraagt aan de thermostabiliteit van de capside. Decoratie-eiwitten verhogen de capsidestabiliteit28,29,51, hoewel er nog andere rollen zijn gepostuleerd52. De drievoudige/kwasi-drievoudige assen worden gestabiliseerd door het DecP74-26 trimer. In vergelijking met mesofiele Caudovirussen interageert de DecP74-26-trimeer met meer subeenheden over een veel groter interactiegebied (Fig. 8a). Het totale interactiegebied per DecP74-26 subeenheid is vrij opmerkelijk: ~4100;Å2 voor een 146-residue eiwit. Onze vorige studie toonde aan dat DecP74-26 substantieel stabieler is dan zijn mesofiele homologen, en dat deze stabilisatie vooral het gevolg is van de vorming van een buitengewoon hechte trimer23. De trimerisatie-interacties maken echter slechts een klein deel uit van het totale interactiegebied van DecP74-26 (~18% van het totale interactiegebied per DecP74-26-subeenheid). Dit suggereert dat de DecP74-26 interactie met de capsid een substantiële hoeveelheid stabiliteit bijdraagt.
Interacties tussen DecP74-26 trimeren vormen een kooi die de capsid bij elkaar houdt (Fig. 8b). Deze opstelling is uniek voor P74-26. Bijvoorbeeld, fagen lambda en TW1 gebruiken een zeer gelijkaardige Decoration Protein vouwing23, maar de interactie van hun Dec-arm met andere capsid eiwitten is veel beperkter29,44. Bovendien maakt het niet-verwante decoratie-eiwit van faag L geen verbinding met naburige trimeren, en ontbreekt het in feite op de quasi-drievoudige assen52. T4 faag is gedecoreerd met het Soc eiwit dat interageert met naburige Soc subeenheden op de drievoudige en quasi-drievoudige assen; Soc is echter aanwezig in relatief lage bezetting (~50%), zodat de kooi onvolledig is41. Omdat decoratie-eiwitten meestal afwezig zijn in de procapside29, verwachten we dat de DecP74-26 kooi bij capside-expansie coöperatief zou assembleren om de capside te stabiliseren. Toekomstige experimenten zullen de rol van coöperativiteit in assemblage en stabiliteit onderzoeken.
De architectonische verbeteringen in P74-26 MCP en Dec zorgen voor stabilisatie tegen hoge interne druk. Hoe werken de krachten van de interne druk in op de capside, en hoe weerstaat de capside-architectuur deze spanningen? Als we aannemen dat de druk van ingekapseld DNA gelijkmatig verdeeld is over de isometrische capside, dan ondervinden alle punten op de capside een vector van kracht die loodrecht staat op het oppervlak van de capside. Naar analogie ondervindt de capside krachten die vergelijkbaar zijn met die van een ballon. De interne druk veroorzaakt dus laterale spanningen op de interacties tussen de capsiden. Hoewel de hoge interne druk die de faag vertoont een uitdaging vormt voor de capsidestabiliteit, kan het stabiliteitsmechanismen mogelijk maken die steunen op tensegrity. Het is mogelijk dat de interne druk kan worden aangewend om een deeltje te produceren dat gestabiliseerd wordt door de spanning op de individuele subeenheden. Ter ondersteuning hiervan kunnen picornavirus capsiden, die met aanzienlijk minder interne druk te maken hebben, gestabiliseerd worden door kleine modificaties aan de capsid53.
De architectuur van de P74-26 capsid is geconstrueerd om laterale spanning te weerstaan door middel van spanningsintegriteit. Tensionele integriteit, of tensegrity, is een gegeneraliseerd mechanisme voor architectonische stabiliteit waarbij gestructureerde regio’s bij elkaar worden gehouden door een netwerk van flexibele elementen die onder voortdurende spanning staan54. In de P74-26 capsid zijn de A- en P-domeinen de gestructureerde gebieden, en de lasso’s en verlengde armen zijn de flexibele elementen die spanning overbrengen. Bijvoorbeeld, de lasso van de E-lus zal strak komen te staan tegen de paal die gevormd wordt door de G-lus en het P-domein van de buurman. Evenzo vormt de N-arm een lasso waarvan het uiteinde op zijn plaats wordt gehouden door de S-lijn die vastklikt in de groef tussen de onderarm en de hand (Fig. 6c). Zo voorspellen we dat de S-lus de kenmerken vertoont van een vangstbinding, een niet-covalente binding die sterker wordt onder spanning55. Bovendien bevat de P74-26 capsid verschillende flappen die met elkaar interleveren. Deze interacties zouden topologisch weerstand bieden aan de laterale en longitudinale spanningen van de interne druk. Als geheel gebruiken deze lasso en flap elementen spanning om structureel falen van de capsid te weerstaan. Het tensegrity mechanisme dat hier is waargenomen is gewoon een meer uitgewerkt voorbeeld van capsid tensegrity dat jaren geleden door Caspar is gesuggereerd.56
De lasso, flap, en arm interacties zijn zo geplaatst dat de interne druk de spanning over meerdere bindingen verdeelt. Bijvoorbeeld, de E-lus β-sheet ondervindt krachten langs de as van de sheet. Alle bindingen die de plaat bij elkaar houden staan dus onder spanning, in plaats van de orthogonale geometrie waarin de spanning alleen op de bindingen aan het eind van de plaat staat. Capsidefalen zou gelijktijdige verbreking van veel bindingen vereisen (een afschuifgeometrie), in plaats van een afritsgeometrie waarin de bindingen één voor één verbreken57. Baanbrekende single molecule studies hebben aangetoond dat een afschuivende geometrie veel hogere krachten vereist om te breken dan wanneer krachten optreden in een openritsende geometrie58,59,60. Dus, de P74-26 capsid is zo geconstrueerd dat laterale krachten in een afschuivende geometrie werken, wat resulteert in hoge tensegrity.
Naast de unieke stabiliserende architectuur van de capsid, neemt P74-26 ook een niet-canoniek mechanisme aan voor het veranderen van de capsid-capaciteit. De capsid van P74-26 is groter dan in de meeste Caudovirussen, wat correleert met zijn abnormaal groot genoom. De meeste T = 7 Caudovirussen hebben een genoomgrootte tussen 30 en 50 kb (supplementaire tabel 2), terwijl het genoom van faag P74-26 met 83 kb bijna twee keer zo lang is24. Op basis van de genoomgrootte hadden we voorspeld dat de capside T = 12 zou zijn (gemiddelde genoomgrootte ~80 kb61), hoewel T = 9 of T = 13 mogelijk zou zijn geweest (gemiddelde genoomgrootte ~70 of ~120 kb, respectievelijk). De P74-26 capsid bereikt deze grotere grootte door de capsomeergrootte aanzienlijk te vergroten in plaats van de icosahedrale complexiteit te veranderen. De capsomer is groter omdat de P74-26 MCP meer oppervlakte beslaat dan normaal, ondanks een typische lengte voor MCP. Dientengevolge is de capsomer iets dunner dan normaal (fig. 4b). Het aantal residuen in MCP voorspelt dus niet het totaal bestreken oppervlak, en de genoomgrootte voorspelt niet het aantal triangulaties.
Recentelijk bepaalden Bayfield et al.62 de structuur van een nauw verwante T = 7 thermofiele faag, die op vergelijkbare wijze vergrote capsomeren gebruikt om de capside capaciteit te vergroten. Voor zover wij weten, is dit een niet-kanoniek mechanisme om de capside capaciteit te vergroten. Er zijn twee klassieke mechanismen om een capside te vergroten: (1) het verhogen van het triangulatiegetal en (2) conversie van een isometrische naar prolate kop. In het eerste geval worden hexons toegevoegd over alle vlakken van de capside, terwijl in het tweede hexons worden toegevoegd over tien van de icosahedrale vlakken, zodat de capside in één dimensie wordt uitgerekt (Fig. 9). In beide gevallen blijven de capsomeren even groot. Hier hebben we een derde mechanisme geïdentificeerd voor de evolutie van een grotere capside: het vergroten van de capsomer.
Mechanismen voor het vergroten van de capsidecapaciteit. P74-26 gebruikt een nieuw mechanisme om de capsidecapaciteit te vergroten door de grootte van de capsomeren te vergroten, terwijl de T = 7-geometrie behouden blijft
Deze drie mechanismen hebben zeer verschillende evolutionaire barrières. De twee klassieke mechanismen kunnen door middel van eenvoudige mutaties worden geïmplementeerd en zijn talloze malen waargenomen. In veel virussen wijzigen eenvoudige puntmutaties het triangulatiegetal5,63,64. Bovendien kan het triangulatiegetal van sommige capsiden worden gewijzigd zonder de MCP-sequentie te veranderen3,65,66. Evenzo veranderen eenpuntmutaties in T4-fagen de capside van prolate in isometrische of genereren ze reuzekoppen waarbij de lange as van de prolate kop verlengd is4,67. Daarom lijken de evolutionaire barrières voor het veranderen van het capsidevolume via de twee klassieke mechanismen vrij laag te zijn. De hier geïdentificeerde vergrote capsomeerstrategie vereist daarentegen meerdere, uitgebreide veranderingen in de sequenties van capsideproteïnen. De grotere P74-26 capsid vereist grote veranderingen in de acht afzonderlijke modificaties van de MCP-structuur, evenals de Dec-arm (Figs. 3a, b en 4c, d). Dit roept de vraag op: waarom heeft faag P74-26 deze schijnbaar meer uitdagende evolutionaire strategie gebruikt in plaats van de gemakkelijkere, klassieke strategieën? Welke beperkingen verhinderden de evolutie van een grotere capsid via de klassieke routes?
Onze eerste hypothese is dat de lasso’s, flappen en armen die de P74-26 capsid stabiliseren, een grotere capsomer nodig hebben om te kunnen functioneren. Het is mogelijk dat de lasso’s extra ruimte nodig hebben om genoeg te openen voor een koppelstangstructuur om in te steken. Ook is het mogelijk dat de flappen en armen een bepaalde lengte nodig hebben om hun stabiliserende activiteit te ontketenen. Als dit het geval zou zijn, dan hebben de architecturale elementen die de capside stabiliseren grotere capsomeren nodig dan normaal. In dit scenario is de grotere capsomeer het geselecteerde structurele kenmerk en is de T = 7 geometrie een spandrel: een biologische structuur die eerder een bijproduct van de evolutie is dan het resultaat van directe selectie68. Wij zijn echter geen voorstander van deze hypothese omdat lassos worden gevonden in herpesvirussen, waarbij de HK97 vouw een typische grootte heeft (Herpesvirus MCP’s hebben verschillende andere torendomeinen die de grootte vergroten, maar deze domeinen maken geen deel uit van de hoofdcapsidervloer en dragen niet bij tot de HK97 vouw49). Bovendien bevatten andere Caudovirus MCP’s lange N-armen (b.v. Sf6 faag31) of E-lussen die bijna even wijd geopend zijn als P74-26 (b.v. P22 faag43), maar deze proteïnen zijn van typische grootte. Niettemin blijft deze hypothese ongetoetst.
Een tweede hypothese is dat de grootte van het genoom en de capaciteit van de capside gelijktijdig zijn geëvolueerd door kleine gelijktijdige toenames. Als de voorouderlijke faag een iets groter genoom evolueerde dan kan worden ondergebracht in de capsid, dan kan er selectieve druk zijn voor een iets groter capsid. Verhoging van het T-getal of overgang naar een prolate kop vergroot het capsidovolume aanzienlijk, wat resulteert in grote dalingen van de interne druk. Deze overgangen kunnen worden ontmoedigd omdat de interne druk gehandhaafd moet blijven voor infectie26. Om grote veranderingen in interne druk te vermijden, kunnen grotere capsomeren langzaam co-evolueren met een groter genoom.
Onze laatste hypothese is dat de geometrie van de capsid een direct effect heeft op de totale stabiliteit van de capsid. Wij stellen de hypothese dat de T = 7 geometrie inherent stabieler is dan hogere driehoeksgetallen, vanwege variabele conformatie van hexonen. Alle capsiden die T = 9 of hoger zijn, hebben meer dan één type hexon, terwijl alle capsiden T ≤ 7 precies één type hexon hebben (behalve T = 1, dat geen hexonen heeft69,70). Bijvoorbeeld, T = 7 heeft een enkelvoudig-pucker hexon conformatie, terwijl T = 9 zowel gevleugelde als platte hexons heeft (supplementaire Fig. 11a, b). We merken ook op dat prolaatvormige capsiden meerdere soorten hexonen hebben (in het algemeen drie of meer hexonconformaties; Fig. 9). Dus, belangrijke capsid eiwitten in T > 7 virussen moeten de hexon conformationele heterogeniteit accommoderen, wat de stabiliteit negatief kan beïnvloeden.
We stellen de hypothese dat T = 7 geometrie de hoogste complexiteit (d.w.z. grootste omvang) is die inherent stabiel is. Complexere geometrieën zouden instabiliteit introduceren door variatie in hexonconformatie. Deze inherente instabiliteit kan extra stabilisatiemechanismen vereisen, zoals decoratieproteïnen om de structuur op zijn plaats te houden. We zien twee nadelen van de T > 7 geometrie, die elkaar niet uitsluiten. Ten eerste moet elk van de afzonderlijke hexonconformaties functioneel en stabiel blijven, wat de evolutie van MCP-proteïnen voor een grotere stabiliteit zou beperken. Het tweede voordeel is dat een lager triangulatiegetal resulteert in minder subunit-subunit raakvlakken, waardoor het aantal zwakke punten in de capsid geminimaliseerd wordt. Ter ondersteuning van deze hypothese heeft het extremofiele, archaeale virus HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) zijn ~68 kb genoom verpakt in een T = 7 kop71. HSTV-2 gebruikt een capsidum dat groter is dan normaal, en heeft ook trimerische decoratie-eiwitten die op de drievoudige/quasi-drievoudige assen zitten. Het feit dat dit mechanisme voor capsidevergroting alleen bij extremofielen is waargenomen, ondersteunt het idee dat de T = 7-geometrie een gunstig effect heeft op de stabiliteit. Om onze hypothese verder te ondersteunen, gebruiken alle bekende T > 7 capsiden decoratie-eiwitten (voor zover wij weten), terwijl veel T = 7 virussen geen decoratie-eiwitten hebben.
Als verschillende driehoeksgetallen verschillende inherente stabiliteit hebben, zou dit suggereren dat elke geometrie zwakke punten vertoont in verschillende regio’s van de capside, zoals is voorspeld uit theoretisch werk72. Wij stellen de hypothese dat de drievoudige/quasi-drievoudige assen de zwakke punten vertegenwoordigen in een T = 7 rooster. Ter ondersteuning van deze hypothese worden decoratie-eiwitten van T = 7 Caudovirussen vaak aangetroffen op de drievoudige/quasi-drievoudige assen (supplementaire tabel 2)29,44,52. Bovendien worden deze assen gestabiliseerd door covalente cross-links in HK97 faag45 en T-lus flappen in P74-26 (Fig. 7b). Om dit idee verder te onderzoeken, merken we op dat T = 9 fagen ook decoratie-eiwitten gebruiken op de drievoudige assen73,74, terwijl T = 12 en T = 13 fagen decoratie-eiwitten gebruiken op de centra van capsomeren61,75,76.
We merken op dat al onze analyses zich voornamelijk hebben gericht op Caudovirussen. Deze virussen breken over het algemeen hun capsiden niet af als onderdeel van hun levenscyclus, zodat de capsid geen selectieve druk heeft om labiel te zijn. In feite levert de hoge druk van verpakt DNA een hoge selectieve druk op om stabiele capsiden te evolueren. Het is waarschijnlijk dat andere soorten virussen andere stabiliteitsmechanismen gebruiken, met name virussen die hun capsiden ontmantelen als een noodzakelijk onderdeel van hun levenscyclus.