Free Press

Introductie

Om de wereldbevolking, die in 2050 naar verwachting 9 miljard zal bedragen, van voldoende voedsel en voeding te voorzien (http://www.unpopulation.org), moet de rijstopbrengst met ten minste 60% toenemen (FAO 2009). Rijst is het basisvoedsel van meer dan de helft van de wereldbevolking en deze rijstconsumerende bevolking neemt toe met 1,098% per jaar (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Een toenemende bevolking betekent een grotere vraag naar voedsel, water en land in een tijd waarin de natuurlijke hulpbronnen voor de landbouw worden aangetast doordat grote stukken landbouwgrond worden omgeschakeld van voedselproductie naar industrialisatie en de productie van biobrandstoffen. Een onvoorspelbare klimaatverandering dreigt de landbouwgrond nog verder in te krimpen door meer gevallen van droogte en overstromingen (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Nu de wereldbevolking toeneemt en de mondiale klimaatverandering de voedselvoorziening steeds meer onder druk zet, is het van essentieel belang dat we de graanproductiviteit van onze gewassen blijven verbeteren om gelijke tred te houden met de bevolkingsgroei. De toename van de productiviteit van de gewassen door de plantensoorten die tijdens de groene revolutie werden gecreëerd, ondersteunde de bevolkingsgroei na de twee wereldoorlogen. Sindsdien is, ondanks het gebruik van verbeterde variëteiten en geavanceerde technologieën, het opbrengstpotentieel van de huidige rijstcultivars slechts weinig verbeterd, wat erop wijst dat deze variëteiten een opbrengstplafond hebben bereikt (Akita 1994). Onlangs is een poging ondernomen om het opbrengstpotentieel van rijst te verhogen door een efficiënte fotosynthese van het C4-type in rijst in te bouwen (Kajala et al. 2011). Daartoe moet een reeks genen die de bladanatomie en de biochemische processen regelen, in rijst worden ingebouwd en op de juiste manier tot expressie worden gebracht, wat momenteel niet mogelijk is met alleen conventionele plantveredelingstechnieken. Daarom zou genetische manipulatie om de fotosynthetische route van rijst te verbeteren, voldoende mogelijkheden bieden om zowel de huidige graanproductiviteit als het opbrengstpotentieel te verbeteren. Genetische manipulatie biedt een efficiënt en nauwkeurig veredelingsinstrument waarbij alleen de genen van belang kunnen worden geïntroduceerd, zelfs van ver verwante soorten.

In C3-planten zoals rijst wordt CO2 door het fotosynthese-enzym ribulose-1, 5-bisfosfaat carboxylase oxygenase (Rubisco) geassimileerd tot een 3-koolstofverbinding. Zoals de naam al aangeeft, katalyseert Rubisco ook de oxidatie van ribulose-1, 5-bisfosfaat (RuBP) in een verspillend proces dat bekend staat als fotorespiratie en dat kan leiden tot een verlies van tot 25% van de eerder vastgelegde koolstof (Sage 2004). Bij temperaturen boven 30°C, wat typisch is voor tropische rijstteeltgebieden in de wereld, neemt de zuurstofopname aanzienlijk toe, waardoor de fotosynthese-efficiëntie van C3-planten tot 40% daalt (Ehleringer en Monson 1993). De fotosynthese van rijst in de tropen en de warme gematigde streken wordt daardoor inefficiënt. De C4-planten, die een CO2-concentratiemechanisme in hun bladeren hebben, hebben een sterk verminderde fotorespiratie en zijn dus geëvolueerd om te gedijen in hete, dorre omgevingen en bieden waardevolle inzichten voor strategieën ter verbetering van gewassen. Rijst met een C4-fotosynthesemechanisme zou een hogere fotosynthetische efficiëntie hebben, terwijl schaarse hulpbronnen zoals land, water en kunstmest, met name stikstof, efficiënter worden gebruikt (Hibberd et al. 2008). Omdat C4-rijst goed presteert bij hoge temperaturen en minder water en stikstof nodig heeft, zou het voordelen bieden voor verschillende soorten rijst-ecosystemen, waaronder marginale gronden.

Fotosynthese van het C4-type is een van de drie soorten biochemische mechanismen die door planten worden toegepast om CO2 uit de atmosfeer vast te leggen; andere zijn de C3- en de Crassulaceenzuurstofwisseling (CAM)-routes. C4-fotosynthese is meer dan 66 keer onafhankelijk geëvolueerd (Sage et al. 2012) in ten minste 19 families tijdens de evolutie van angiospermen uit C3-voorouders (Muhaidat et al. 2007) en brengt veranderingen met zich mee in de celstructuren, de biochemie en dus ook in de ontwikkeling van de bladeren. Deze zeer gespecialiseerde vorm van fotosynthese heeft in wezen een CO2-concentratiemechanisme rond het Rubisco-enzym ontwikkeld, waardoor de oxygenase-functie van Rubisco wordt uitgeschakeld en energieverspilling door fotorespiratie wordt tegengegaan (Douce en Heldt 2000). Rubisco van C4-soorten is efficiënter dan van C3-soorten wat carboxylering betreft (Kubien et al. 2008). Andere voordelen van het C4-systeem zijn een hogere watergebruiksefficiëntie omdat een steilere concentratiegradiënt voor CO2-diffusie kan worden gehandhaafd door gedeeltelijk gesloten huidmondjes, een hogere stralingsgebruiksefficiëntie omdat de C4-fotosynthese-efficiëntie niet verzadigd raakt bij een hoge lichtintensiteit (Rizal et al. 2012) en een hogere stikstofgebruiksefficiëntie omdat er minder Rubisco en dus minder stikstof nodig is.

C4-planten zijn potentieel productiever bij hogere temperaturen waar rijst gewoonlijk mee te maken heeft. Om te profiteren van dit efficiëntere fotosynthetische systeem in een tijd waarin de bevolking en de voedselprijzen de pan uit rijzen, wordt getracht het C4-mechanisme, zoals dat in maïs wordt aangetroffen, in rijst in te bouwen (Rizal et al. 2012). Deze nieuwe aanpak om het fotosynthesesysteem van rijst te wijzigen is een uitdagende en langdurige onderneming omdat de C4-route zeer complex is en veel factoren die het mechanisme regelen nog onbekend zijn. Daarom vereist het vindingrijkheid en expertise van wetenschappers die betrokken zijn bij diverse disciplines zoals genetische manipulatie, biochemie, bio-informatica, moleculaire biologie, fotosynthese, systeembiologie, fysiologie, plantenveredeling, metabolomics, enz. Om dezelfde reden werd het C4-rijstconsortium geconcipieerd en opgericht, dat sinds 2009 met de praktische werkzaamheden voor C4-rijstechnologie is begonnen (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Dit overzicht geeft een update van de vereisten voor de ontwikkeling van C4-rijst en de vooruitgang die is geboekt op het gebied van genetische manipulatie. Op basis van de studie van de evolutie van C4 uit C3-soorten en de daarmee gepaard gaande veranderingen, zijn de volgende wijzigingen van essentieel belang om een functionele C4-fotosynthetische route in rijst tot stand te brengen.

Verhoog het aantal en de grootte van chloroplasten in bundelschedecellen van rijst

In rijst bevindt zich meer dan 90% van het totaal aantal chloroplasten in de mesofylcellen (MC’s) binnen het blad (Yoshimura et al. 2004); terwijl in C4-planten zowel MC’s als bundelschedecellen (BSC’s) gelijke aantallen chloroplasten bezitten (Figuur 1A en B). Dit komt omdat in C3-planten het volledige fotosyntheseproces plaatsvindt in de MC, maar in C4-planten is het fotosyntheseproces gecompartimenteerd in MC en BSC. De MC’s voeren de eerste CO2-fixatie uit waarbij een 4-koolstofverbinding, oxaloacetaat genaamd, wordt gevormd en dit wordt omgezet in C4-zuren zoals malaat, die naar de BSC’s worden getransporteerd, waardoor een efficiënte assimilatie van CO2 in koolhydraten door de Calvin-cyclus in de BSC’s mogelijk wordt. Daarom hebben de BSC’s van C4-planten, in tegenstelling tot die van C3-planten, fotosynthetische functies zoals de decarboxylering van de C4-verbinding en het proces van de Calvin-cyclus. Om deze processen uit te voeren zijn de BSC’s in C4-planten vergroot en hebben ze meer chloroplasten, waardoor de BSC’s meer uitgesproken en fotosynthetisch actief zijn. De BSC’s in C3-soorten hebben tot taak de hydraulische druk in evenwicht te houden, te voorkomen dat lucht vanuit de intercellulaire ruimten het xyleem binnendringt, een waterreservoir te vormen om verliezen als gevolg van transpiratie te bufferen, en ervoor te zorgen dat de hogere intensiteit van het licht dat op de nerven valt, het blad binnenkomt en wordt verspreid (Nikolopoulos et al. 2002). Bijkomende functies van BSC’s van C3-planten zijn onder meer het transport van stikstof, zwavel, koolhydraten en de rol in de signaaltransductieroute, die uitvoerig is besproken in (Leegood 2008). In C4-soorten werken BSC’s en MC’s samen in een tweestapsversie van de fotosynthese. Bijgevolg, om een direct contact tussen BSC’s en MC’s te verzekeren, bezitten C4 planten een speciaal soort bladanatomie die gepaard gaat met proliferatie van chloroplasten in BSC’s. Om de C4-route in rijst te introduceren, zijn meer fotosynthetische chloroplasten in de BSC’s nodig dan rijst nu heeft. Dit kan worden gedaan door de genetische elementen die nodig zijn voor de ontwikkeling van chloroplasten, zoals Golden2-achtige (GLK) genen, op een celspecifieke manier tot expressie te brengen met behulp van C4-genpromotors zoals fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC) van Zea mays voor MC-specifieke expressie en fosfoenolpyruvaatcarboxykinase (PCK) promoter van Zoysia japonica voor BSC-specifieke expressie in rijstbladeren (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Golden2-like (GLK) genfamilieleden coderen voor nucleaire transcriptiefactoren waarvan bekend is dat ze de ontwikkeling van chloroplasten reguleren in Arabidopsis, Zea mays en het mos Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). In elk van deze soorten bestaan GLK genen als een homoloog paar, genaamd GLK1 en GLK2 (Waters et al. 2009). In mos en Arabidopsis zijn de GLK genen redundant en functioneel equivalent, terwijl in maïs en sorghum GLK genen op een celtype-specifieke manier de ontwikkeling van dimorfe chloroplasten sturen (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). In maïs accumuleren Golden2 (G2) en zijn homoloog ZmGLK1 transcripten voornamelijk in respectievelijk BS- en M-cellen, wat een specifieke rol suggereert voor elk gen dat de dimorfe chloroplastdifferentiatie reguleert (Wang et al. 2013a).

Vermindering van de nerfafstand waardoor de nerfdichtheid in het blad toeneemt

In C3-soorten vindt de fotosynthese plaats in de MC’s. Een groot aantal MC’s tussen de opeenvolgende nerven (Figuur 1A) duwt de nerven ver van elkaar waardoor de nerfafstand toeneemt of de nerfdichtheid afneemt. In rijst bladeren zijn er minder dan 6 aderen per mm (figuur 2A), Setaria viridis en sorghum (beide zijn typische C4 soorten) hebben meer dan 7 aderen per mm (figuur 2B en C). C4 bladeren hebben gemiddeld 2 MCs tussen de aderen (figuur 1B). De hogere aderdichtheid in de bladeren van C4 planten leidt tot een bijna een-op-een verhouding van de volumes van M en BS weefsels. De interne anatomie van een C4 blad is vaak samengesteld uit een herhalend patroon van ader-BS-M-BS-veine. BSC’s omgeven door MC’s vormen een kransvormige structuur; dit type van bladanatomie werd door de Duitse botanicus G. Haberlandt “Kranz-anatomie” genoemd. C4 BSC’s hebben een dicht cytoplasma en zijn gevuld met grote aantallen chloroplasten (Figuur 1B). Voor de efficiënte werking van de C4-route is een nauw contact tussen M- en BS-cellen onontbeerlijk en deze zijn nauw met elkaar verbonden door grote aantallen plasmodesmata Dengler en (Nelson 1999). De Kranz-anatomie wordt met weinig variatie aangetroffen in bijna alle monocotyledonische en dicotyledonische lijnen die gebruik maken van de tweecellige C4-fotosyntheseweg. Studies over bladanatomie en -morfologie hebben verschillende genen aan het licht gebracht die verantwoordelijk zijn voor de groei, ontwikkeling of misvormingen van cellen in bladeren. Een gen ACAULIS1 was verantwoordelijk voor de verlenging van de bladcellen (Tsukaya et al. 1993). Mutatie in het gen CURLEY LEAF (CLF) veroorzaakte gekrulde bladeren in Arabidopsis (Kim et al. 1998). Toename van vrije nerven, open venatiepatroon en afgeronde bladstructuur werden veroorzaakt door rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). Mutatie in het Scarecrow-gen in maïs toonde toename van het aantal BSC’s, ongewone differentiatie van de BS chloroplast, afname van de kleine nerven en verandering in de nerfdichtheid (Slewinski et al. 2012). Deze studies in verband met de abnormale aderpatronen veroorzaakt door mutatie van bepaalde genen geven een aanwijzing over hoe de Kranz-anatomie wordt gereguleerd en suggereren betrokkenheid van meerdere paden bij de ontwikkeling van het Kranz-patroon. Er is vastgesteld dat het SCARECROW/SHORTROOT reguleringsnetwerk een van de belangrijke componenten is die nodig zijn voor de Kranz anatomie patroonvorming, omdat de bladeren van C3 planten met gemuteerd Scarecrow gen normaal waren, terwijl in de C4 planten mutatie in hetzelfde gen de Kranz anatomie beschadigde (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Onlangs is aangetoond dat introductie van maïschromosomen in haver de BSC-grootte kon vergroten en de afstand tussen de nerven in C3-haverbladeren kon verkleinen, wat aantoont dat de anatomie van C3-blad kan worden gewijzigd (Tolley et al. 2012). Bovendien werden grote inspanningen geleverd om mutanten van sorghum (C4) met grotere aderafstand en mutanten van rijst (C3) met kleinere aderafstand te screenen, zodat de genen die de aderafstand controleren, kunnen worden geïdentificeerd (Rizal et al. 2012).

De activiteit van de Calvin-cyclus zou in MC aanzienlijk moeten worden verminderd en in BSC van rijst sterk moeten worden verhoogd

C4-fotosynthese wordt gekenmerkt door een biochemisch CO2-pompmechanisme dat de concentratie van CO2 ter hoogte van Rubisco verhoogt. Een hoog CO2-niveau rond Rubisco vermindert de snelheid van de fotorespiratie en verhoogt de netto CO2-assimilatie, wat leidt tot een zeer efficiënte fotosynthese Weber en von (Caemmerer 2010). Om dit te bereiken is de CO2-assimilatie in C4 verdeeld over twee celtypes, de MC’s en BSC’s (figuur 3). Daarom is C4-koolstoffixatie afhankelijk van celspecifieke genexpressie en -lokalisatie. De naburige fotosynthetisch actieve BS- en M-cellen werken samen om Rubisco-gekatalyseerde O2-fixatie te elimineren. In tweecellige C4-planten wordt CO2 eerst gefixeerd in het C4-zuur oxaloacetaat in MC’s door een O2-ongevoelig carboxylase, fosfoenolpyruvaatcarboxylase (PEPC, EC 4.1.1.31) genoemd. Het oxaloacetaat wordt vervolgens omgezet in malaat of aspartaat en wordt getransporteerd naar BSC’s waar het wordt gedecarboxyleerd en de CO2 vrijkomt. Dit CO2 wordt opnieuw gebonden door Rubisco en alle daaropvolgende activiteiten van de Calvijncyclus vinden plaats in de chloroplasten van de BSC’s (Nelson en Langdale 1989). Om functionerende C4-rijst te maken, moet de Rubisco-activiteit bijgevolg sterk worden verminderd in de MC’s en verhoogd in de BSC’s, waardoor de Calvin-cyclus wordt beperkt tot de BSC’s van rijst, zoals in een C4-systeem. Anderzijds moeten bepaalde genen die coderen voor de C4-enzymen, zoals β koolzuuranhydrase (CA) en PEPC, tot overexpressie komen in het cytosol van de MC’s van rijst om de primaire CO2-fixatie te vergemakkelijken, zodat CO2 kan worden geconcentreerd en aan Rubisco in de BSC’s kan worden geleverd. De C4-cyclus omvat ook uitgebreid transport van metabolieten over het chloroplastomhulselmembraan en het plasmalemma van het MC en de BSC (figuur 3). Naast de belangrijkste C4-enzymen, namelijk CA, PEPC, pyruvaat-orthofosfaat (Pi)-dikinase (PPDK, EC 2.7.9.1), NADP-afhankelijk malaatdehydrogenase (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) en NADP-afhankelijk malatenzym (NADP-ME, EC 1.1.1.40), worden in de C4-cyclus ook NADP-afhankelijk malaatdehydrogenase (NADP-MDH, EC 1.1.1.40) en NADP-afhankelijk malatenzym (NADP-ME, EC 1.1.1.40) gebruikt.40), vereist de C4-cyclus ook dat metaboliettransporteurs voor oxaloacetaat, malaat, triosefosfaat en pyruvaat in rijst worden ingebracht om een grotere transportcapaciteit voor de tussenproducten van de C4-cyclus te verkrijgen, zodat de Calvijn-cyclus effectief kan functioneren in de BSC’s (Weber en von Caemmerer 2010).

De fotorespiratie in mesofylcellen moet sterk worden gereduceerd

In C3-planten vinden de koolstoffixatie en de Calvin-cyclus plaats in MC’s. Tijdens de koolstoffixatie reageert ribulose-1,5-bisfosfaat (RuBP) – een verbinding van vijf koolstofatomen, gekatalyseerd door een enzym ribulose-1,5-bisfosfaat-carboxylase-oxygenase (Rubisco, EC.4.1.1.39) met CO2 tot twee moleculen van een verbinding van 3 koolstofatomen, het 3-fosfoglyceraat (3-PGA). In de Calvin-cyclus vormen de twee PGA-moleculen een energierijke suikermolecule (triosefosfaat) en regenereren ze RuBP voor de volgende cyclus. Bij de huidige atmosferische CO2-concentraties (ca. 400 ppm) katalyseert Rubisco ook een reactie tussen RuBP en O2, wat resulteert in telkens één molecuul 2-fosfoglycolaat en 3-PGA (Peterhansel en Maurino 2011). Het 2-fosfoglycolaat moet weer worden omgezet in 3-PGA via het proces dat fotorespiratie wordt genoemd en dat een reeks biochemische reacties omvat. Tijdens dit proces treedt een verlies op van eerder gefixeerde koolstof en stikstof en moet ook extra energie worden gebruikt (Sharpe en Offermann 2013).

C4 planten hebben mechanismen ontwikkeld om de lokalisatie en activiteiten van Rubisco in BSC’s te beperken. MC’s verhinderen ruimtelijk het contact tussen Rubisco in BSC’s en O2 in de intercellulaire ruimten, waardoor verlies van energie door fotorespiratie wordt voorkomen. De uitschakeling van fotorespiratie door C4-planten blijkt uit hun zeer lage CO2-compensatiepunt dat bijna nul is en hun constant hoge carboxyleringsefficiëntie (CE) zonder te reageren op de veranderingen in O2-concentraties (figuur 4). Bij C3-planten daarentegen daalde het compensatiepunt bij een wijziging van de O2-concentratie van 21% tot 2% aanzienlijk, namelijk van 55 tot 30 ppm (tabel 1). In figuur 4 werd het CE berekend volgens (Li et al. 2009) waaruit bleek dat het CE van sorghum niet significant veranderde met de verandering in het O2-niveau, maar in rijst was er een zeer significante verbetering van het CE wanneer het O2-niveau daalde van 21 naar 2% (figuur 4 en tabel 1). De toename van het CE in sorghum bedroeg slechts 6,1%, terwijl dat in rijst 41,5% was bij een verlaging van de intercellulaire O2-concentratie tot 2% (tabel 1). Deze gegevens tonen aan dat er een groot potentieel is om de fotosynthesecapaciteit van rijst te verhogen door de fotorespiratie te verminderen, wat op zijn beurt de opbrengst aanzienlijk zou verhogen. Eén manier om de fotorespiratie in MC te verminderen is door het glycine decarboxylase (GDC) eiwit in MC te verminderen en de accumulatie ervan in BSC te beperken, zodat de decarboxylering van glycine uitsluitend in BSC plaatsvindt, waardoor een hogere CO2 concentratie in BSC wordt gegenereerd, vergelijkbaar met die in C3-C4 tussenproducten (Monson en Rawsthorne 2000). Het C4-rijstconsortium test deze aanpak door gebruik te maken van kunstmatig microRNA dat is ontworpen tegen de GDC-H-subeenheid van rijst en wordt aangestuurd door de ZmPEPC-promotor (Kajala et al. 2011). Een dergelijk biochemisch mechanisme vereist cellulaire specialisatie van de BSC’s, waaronder een toename van het aantal chloroplasten en mitochondriën, waardoor de organelinhoud van de rijst BSC’s wordt verrijkt om te helpen bij het vastleggen van de CO2 die vrijkomt bij de decarboxylering van glycine door GDC (Ueno 2011). Een andere succesvolle benadering om de CO2 die vrijkomt door de fotorespiratie vast te leggen op de plaats van de fotosynthese is de overdracht van de glycolaat katabole route van Escherichia coli naar de chloroplasten van Arabidopsis thaliana, waarbij glycolaat in de chloroplast direct werd omgezet in glyceraat (Kebeish et al. 2007). Deze strategie die de fotorespiratie verminderde en de fotosynthese in Arabidopsis verbeterde, impliceerde een stapsgewijze nucleaire transformatie met vijf chloroplastgerichte bacteriële genen die coderen voor glycolaatdehydrogenase, glyoxylaatcarboligase en tartronisch semialdehydereductase, zou kunnen worden toegepast op andere C3-planten zoals rijst, maar het gebruik van bacteriële genen is wellicht niet wenselijk bij de engineering van C4-rijst.

Engineering van de C4-route in rijst

Men dacht dat een eencellig C4-systeem sneller in C3-planten zou kunnen worden ingebouwd. Er zijn pogingen om eencellige C4 fotosynthese systeem ook in rijst (Miyao et al. 2011). Om een eencellige C4-achtige route te introduceren waarbij MC CO2 vasthoudt en weer vrijgeeft op de manier zoals dat in Hydrilla verticillata (L.f) Royle gebeurt, werden vier enzymen (PEPC, PPDK, NADP-MDH, en NADP-ME) die bij de route betrokken zijn overgeproduceerd in de transgene rijstbladeren (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Enkele van de belangrijkste problemen die moeten worden aangepakt om een ééncellige C4-achtige route in rijst te maken zijn: mechanisme om de transportactiviteit van PEP over de chloroplastenvelop te vergemakkelijken, de invoer van OAA in de chloroplasten en de richting van de NADP-ME reactie, betrokkenheid van NADP-MDH, de aanwezigheid van endogene PEPC in de MC chloroplast van rijst en verdere verhoging van de NADP-MDH activiteit werden noodzakelijk geacht (Miyao et al. 2011). Terrestrische eencellige C4 soorten zoals Bienertia cycloptera, B. sinuspersici en Suaeda aralocaspica, behorend tot de Chenopodiaceae familie hebben ook ruimtelijke compartimentering nodig voor de assimilatie en decarboxylering van koolstof (Chuong et al. 2006). Deze soorten hebben dimorfe chloroplasten in deze compartimenten. De eerdere pogingen leverden een vergeefse cyclus op die te wijten was aan geen verandering in de anatomie, het ontbreken van geschikte transporters en het feit dat de in rijst getransformeerde maïsgenen niet op de juiste celspecifieke wijze tot expressie kwamen en niet gereguleerd werden zoals in maïs, maar wel zoals de endogene C3-isovormen in rijst (Miyao et al.

Om de fotosynthetische route van C3 naar C4 binnen twee decennia te engineeren, wat in de natuur miljoenen jaren duurde, begon het C4-rijstconsortium met de gelijktijdige ontdekking van genen en engineering van reeds bekende genen in rijst, met als doel C4-rijst te vormen met Kranz-type anatomie. C4-genen zoals CA, PEPC, PPDK, NADP-ME, en NADP-MDH zijn gekloond uit maïs en getransformeerd in rijst. Ook de transporters die tot overexpressie kwamen in de C4 metabolische routes zoals 2-oxoglutaraat/malaat transporter (OMT1), dicarboxylaat transporter1 (DiT1), dicarboxylaat transporter2 (DiT2), PEP/fosfaat transporter (PPT1), mesofyl envelope proteïne (MEP) en triosefosfaat fosfaat translocator (TPT) die onlangs werden geïdentificeerd via proteomics van maïs BS en MS cellen (Friso et al. 2010) worden getransformeerd in rijst (figuur 3). De leden van het C4-rijstconsortium zijn ook betrokken bij de ontdekking van nieuwe genen die verband houden met de anatomie van Kranz (Wang et al. 2013b). Zodra ze zijn getest, zullen de veelbelovende kandidaat-genen die de Kranz-anatomie controleren ook worden geïntroduceerd in de rijstplanten die zijn gemanipuleerd met de C4-biochemische pathway-genen.