Jesteś na lotnisku i tracisz czas na przygotowanie raportu dla swojego profesora, który ma być gotowy jutro rano. Masz swoje dane. Dlaczego nie wykorzystać tego czasu i nie obliczyć zmiany fałdowej ekspresji dla genów, które testowałeś w tym pierwszym eksperymencie qPCR, który wykonałeś w zeszłym tygodniu?
To proste – pokażę Ci jak.
Sprawdź swoją metodę
Istnieją dwa główne sposoby analizy danych qPCR: analiza podwójnej delty Ct i metoda względnej krzywej standardowej (metoda Pfaffla). Obie metody przyjmują założenia i mają swoje ograniczenia, więc metoda, której powinieneś użyć do analizy, będzie zależała od twojego projektu eksperymentu.
Analiza podwójnego delta Ct zakłada, że:
- między zestawami primerów jest równa wydajność primera (tj. w granicach 5%);
- jest blisko 100% skuteczność amplifikacji genów referencyjnych i docelowych;
- geny kontroli wewnętrznej ulegają ciągłej ekspresji i nie ma na nie wpływu leczenie.
Metoda ta generalnie nadaje się do eksperymentów z dużą liczbą próbek DNA i małą liczbą genów do zbadania.
Metoda względnej krzywej standardowej zakłada, że:
- między próbkami kontrolnymi i leczonymi są równe wydajności.
Ta metoda działa lepiej, jeśli masz mniej próbek DNA, ale większą liczbę genów do przetestowania.
Czego potrzebujesz do analizy Double Delta Ct
- wartościqPCR Ct (dane surowe) dla:
- genu domowego: warunki kontrolne i eksperymentalne;
- genu zainteresowania: warunki kontrolne i eksperymentalne;
- arkusza kalkulacyjnego Excel.
I to wszystko! Nie jest wymagane drogie oprogramowanie.
Tutaj znajduje się szybkie podsumowanie kluczowych kroków w analizie podwójnej delty Ct (aby uzyskać szczegółowe wyjaśnienie, przeczytaj ten artykuł).
4 Steps for Double Delta Ct Analysis
1. Weź średnią z wartości Ct dla genu utrzymującego i badanego genu w warunkach eksperymentalnych i kontrolnych, zwracając 4 wartości. Te 4 wartości to gen badany eksperymentalny (TE), gen badany kontrolny (TC), gen housekeeping eksperymentalny (HE) i gen housekeeping kontrolny (HC).
| Średnia Eksperymentalna Wartość Ct | Średnia Eksperymentalna Wartość Ct | Średnia Kontrolna Wartość Ct | Średnia Kontrolna Wartość Ct | DeltaCt Value. (Experimental) | \NDeltaCt Value (Control) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | DeltaCTE | DeltaCTC | ||
| 21.27 | 20.23 | 19.60 | 19.27 | 1.03 | 0.33 |
2. Oblicz różnice pomiędzy wartościami eksperymentalnymi (TE – HE) a wartościami kontrolnymi (TC – HC). To są twoje wartości \DeltaCt odpowiednio dla warunków eksperymentalnych (\DeltaCTE) i kontrolnych (\DeltaCTC).
3. Następnie oblicz różnicę między wartościami \DeltaCT dla warunków eksperymentalnych i kontrolnych (\DeltaCTE – \DeltaCTC), aby otrzymać wartość podwójnego delta Ct (ddCt).
4. Ponieważ wszystkie obliczenia są w logarytmie o podstawie 2, za każdym razem, gdy jest dwa razy więcej DNA, twoje wartości Ct zmniejszają się o 1 i nie zmniejszają się o połowę. Musisz obliczyć wartość 2^{-2Delta C_{t}}, aby uzyskać zmianę fałdową wyrażenia.
| dCt Value (Experimental) | dCt Value (Control) | ddCt Value | Expression Fold Change |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0.33 | 0.70 | 0.615572207 |
What Does the Value Mean?
Now that you have your value for fold change, what does it actually mean? Wartość ta jest zmianą fałdową interesującego nas genu w warunkach testowych w stosunku do warunków kontrolnych, które zostały znormalizowane do naszego genu domowego.
Aby uczynić to nieco bardziej zrozumiałym – można myśleć o tym jako o wartości procentowej. Fałdowa zmiana o wartości 1 oznacza, że jest 100% tyle samo ekspresji genu w twoim stanie testowym, co w twoim stanie kontrolnym – więc nie ma żadnej zmiany między grupą eksperymentalną a grupą kontrolną. Wartość fold-change powyżej 1 wskazuje na wzrost ekspresji interesującego nas genu w stosunku do kontroli (1,2-krotna zmiana = 120% ekspresji genu w stosunku do kontroli, 5 = 500%, 10 = 1,000%, itd.) Wartości poniżej 1 wskazują na downregulation genu w stosunku do kontroli (fold change of 0.5 is 50% gene expression relative to control, so half as much expression as in the control, etc.).
Możesz przedstawić te dane w postaci wykresów słupkowych fold-change, wykresując warunki kontrolne równe 1. Możesz również użyć analiz statystycznych do sprawdzenia istotności zmian, np. używając analizy wariancji (ANOVA) lub t-testów, cokolwiek jest odpowiednie dla twojej konfiguracji eksperymentalnej!
Używając tych kroków możesz przeprowadzić analizę qPCR gdziekolwiek jesteś, nawet jeśli jesteś w podróży. Aby jeszcze bardziej ułatwić pracę, można utworzyć szablon w programie Excel, który będzie używany za każdym razem. Wtedy będziesz musiał tylko wprowadzić swoje dane i będziesz zadziwiał innych swoim zapałem w przeprowadzaniu analiz!
Originally published July 9, 2016. Reviewed and updated on February 8, 2021.
Further Reading
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2^{-2Delta C_{t}} Method. Methods. 2001;25:402-8.
Czy to Ci pomogło? W takim razie prosimy o udostępnienie go w sieci.
.