Abstract
Infekcje jelitowe są istotną przyczyną zachorowalności i śmiertelności wśród osób żyjących z HIV/AIDS (PLWHA), szczególnie w krajach rozwijających się. Niniejsze badanie zostało przeprowadzone w celu oceny spektrum klinicznego i mikrobiologicznego u chorych na HIV/AIDS z biegunką oraz skorelowania występowania tych patogenów z charakterem stolca, statusem seropozytywności HIV i liczbą CD4. Kał od 154 osób seropozytywnych z HIV i 50 osób z grupy kontrolnej negatywnej z HIV badano za pomocą mikroskopii bezpośredniej, posiewów kału i testów serologicznych (Clostridium difficile Toxin A, antygen Cryptosporidium i antygen Entamoeba histolytica ELISA). Liczbę komórek CD4 T obliczono przy użyciu systemu FACS (Becton Dickinson). W badaniu stwierdzono przewagę mężczyzn (112 mężczyzn i 42 kobiety). Najczęstszymi objawami były: osłabienie, bóle brzucha i brak łaknienia. Pasożyty z rodziny kokcydiów były najczęstszą przyczyną biegunki w przypadkach seropozytywnych HIV. C. parvum występował u 60,42%, a Isospora belli u 9,03%. Spośród patogenów bakteryjnych C. difficile wykryto u 18,06%, biegunkową Escherichia coli u 11,11%, a Shigella spp. u 2,78%. Odsetek izolacji patogenów był wyższy u osób seropozytywnych w kierunku HIV oraz u osób z niską liczbą limfocytów T CD4. Regularne monitorowanie liczby limfocytów CD4 T oraz badania przesiewowe w kierunku patogenów jelitowych przyczynią się do poprawy jakości życia PLWHA.
1. Wprowadzenie
Zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) nakłada na dotknięte nim osoby ogromne cierpienie, a w szczególności w krajach rozwijających się stanowi ogromne obciążenie dla systemu medycznego. Dla dotkniętego ubóstwem i chorobą kraju, takiego jak Indie, plaga HIV/AIDS jest najbardziej niefortunna. Jednym z głównych problemów zdrowotnych wśród pacjentów seropozytywnych z powodu słabnącej odporności są nakładające się na siebie infekcje oportunistyczne, a często obserwuje się, że w trakcie choroby pacjenci stają się mikrobiologicznym zoo. Pacjenci mogą mieć kilka takich równoczesnych infekcji, co skutkuje stanami klinicznymi, które stanowią wyzwanie diagnostyczne i terapeutyczne. Biegunka jest jednym z takich bardzo częstych stanów klinicznych w HIV/AIDS i została uwzględniona jako kryterium definiowania przypadku AIDS. Epizody biegunki mogą być ostre i krótkotrwałe, przerywane lub nawracające, a w niektórych przypadkach przewlekłe i ciężkie. Biegunka może znacznie pogorszyć jakość życia pacjentów, a jeśli się utrzymuje, może powodować odwodnienie, złe odżywianie i utratę masy ciała. Biegunka występuje u 50% pacjentów z HIV/AIDS w krajach rozwiniętych i u nawet 100% pacjentów w krajach rozwijających się. Przyczyny biegunki w AIDS mogą być zakaźne lub niezakaźne. Biegunka nieinfekcyjna może być spowodowana działaniami niepożądanymi związanymi z ART i enteropatią HIV. Wiele badań wykazało, że biegunka zakaźna w HIV/AIDS jest wywoływana przez różne patogeny, w tym pasożyty, bakterie, wirusy i grzyby. Nie ma specyficznej kombinacji patogenów jelitowych w biegunce związanej z HIV, a czynniki etiologiczne różnią się u poszczególnych pacjentów i w poszczególnych krajach, w zależności od rozmieszczenia geograficznego, endemiczności, sezonowej zmienności patogenów jelitowych, a także od stanu odporności pacjenta. Diagnostyka obejmująca mikroskopię bezpośrednią, posiewy kału i badania serologiczne w celu wykrycia specyficznego antygenu i/lub specyficznych przeciwciał jest potrzebna dla każdego pacjenta, ponieważ większość z tych czynników zakaźnych jest uleczalna.
Mając na uwadze poprzednie tło, niniejsze badanie zostało podjęte w celu oceny spektrum klinicznego i mikrobiologicznego w przypadkach HIV/AIDS z biegunką zarejestrowanych w największym trzeciorzędowym szpitalu w Delhi, obsługującym pacjentów nie tylko z Delhi, ale także z sąsiednich stanów Uttar Pradesh, Haryana, Punjab i Himachal Pradesh. Motywem było zrozumienie etiologii bakteryjnej biegunki w takich przypadkach tak, że odpowiednie badania medyczne, specyficzne leczenie i odpowiednie doradztwo żywieniowe może pomóc zmniejszyć koszty społeczno-ekonomiczne i medyczne dla tej choroby w naszym kraju.
2. Materiały i metody
2.1. Badana populacja
Do badania zrekrutowano sto pięćdziesiąt cztery osoby dorosłe zakażone HIV z biegunką, które uczęszczały do kliniki ART w szpitalu Lok Nayak powiązanym z Maulana Azad Medical College, New Delhi, Indie, niezależnie od ich statusu ART. Do badania włączono tylko te osoby z biegunką, które w ciągu ostatnich dwóch tygodni nie otrzymywały żadnej specyficznej terapii przeciwbiegunkowej. Do grupy kontrolnej włączono również 50 losowo dobranych pod względem wieku i płci dorosłych osób seronegatywnych z objawami biegunki, które zgłosiły się na rutynowe badania próbek kału do laboratorium mikrobiologicznego Maulana Azad Medical College, New Delhi. Obiekty, które otrzymały jakąkolwiek specyficzną terapię przeciwbiegunkową w ciągu ostatnich dwóch tygodni i/lub nie były pewne swojego statusu HIV zostały wykluczone z grupy kontrolnej.
2.2. Projekt badania
Badanie to przeprowadzono od kwietnia 2008 roku do czerwca 2011 roku. Była to analiza przekrojowa mająca na celu określenie profilu klinicznego i mikrobiologicznego biegunki u chorych na AIDS i osób z grupy kontrolnej HIV seronegatywnej. Przy włączaniu do badania uzyskano świadomą zgodę i poproszono każdego uczestnika o wypełnienie kwestionariusza, który zawierał dane socjodemograficzne i osobowe, historię epizodów biegunki, objawy kliniczne itd. Od wszystkich uczestników wymagano pobrania próbek kału. Próbki były zbierane do czystego plastikowego pojemnika z zakrętką i transportowane do laboratorium mikrobiologicznego przez samych pacjentów tego samego dnia, aby uniknąć niepotrzebnych opóźnień.
2.3. Definicja biegunki
Biegunkę zdefiniowano jako trzy lub więcej luźnych lub wodnistych wypróżnień w okresie 24 godzin. Ostra biegunka została zdefiniowana jako biegunka, która trwała 7 dni lub krócej w momencie zgłoszenia. Biegunkę przewlekłą definiowano jako biegunkę trwającą dłużej niż 7 dni, ale krócej niż 14 dni w momencie zgłoszenia się do badania. Biegunkę nazywano przewlekłą, jeśli trwała dłużej niż 14 dni .
2.4. Badanie laboratoryjne
Wszystkie próbki kału poddano serii badań mikrobiologicznych. Próbki przechowywano w temperaturze 4 stopni Celsjusza, jeśli nastąpiło opóźnienie w obróbce. Rejestrowano kolor, konsystencję i obecność krwi/śluzu/robaków w próbkach stolca. Próbkę emulgowano w kropli soli fizjologicznej i jodyny Lugola na szkiełku mikroskopowym i badano pod mikroskopem na obecność trofozoitów Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, krwinek czerwonych, komórek ropnych, komórek jajowych helmintów i cyst. Wymazy kału przygotowywano, utrwalano termicznie i barwiono metodą Grama, Kinyouna (zmodyfikowana barwa kwaśna szybka) oraz barwnikiem trichromowym. Wszystkie próbki hodowano bezpośrednio, jak również po wzbogaceniu w bulionie Selenite F i alkalicznej wodzie peptonowej, odpowiednio na agarze z deoksycholanem ksylozy lizyny i agarze z solami żółci. Do izolacji Campylobacter jejuni zastosowano specjalistyczne podłoże selektywne, agar z deoksycholanem cefoperazonu (CCDA), który inkubowano w środowisku mikroaerofilnym w temperaturze 42°C przez 48 godzin. W celu izolacji Aeromonas spp. i Yersinia enterocolitica próbki kału hodowano odpowiednio na podłożu selektywnym Aeromonas i selektywnym Yersinia. Organizmy zostały zidentyfikowane na podstawie cech kolonii, testów biochemicznych oraz serologicznie za pomocą testu aglutynacji szkiełkowej przy użyciu dostępnych w handlu specyficznych antysurowic. Wykrywanie toksyny A C. difficile, antygenu Cryptosporidium i antygenu E. histolytica w próbkach kału przeprowadzono przy użyciu dostępnych w handlu zestawów Enzyme Immunoassay.
Liczbę limfocytów T CD4 wszystkich uczestników określono metodą FACS firmy Becton Dickinson.
2.5. Analiza statystyczna
Do badania korelacji pomiędzy częstością występowania patogenów jelitowych a konsystencją stolca zastosowano test Kruskala-Wallisa. Do badania zależności między częstością izolacji patogenów jelitowych a statusem seropozytywności HIV i liczbą limfocytów T CD4 zastosowano test chi kwadrat i dokładny test Fishera.
3. Wyniki
Spośród stu pięćdziesięciu czterech osób seropozytywnych HIV 112 (72,73%) było mężczyznami, a 42 (27,27%) kobietami. 64,94% badanych znajdowało się w grupie wiekowej 26-35 lat, czyli w grupie osób aktywnych seksualnie. Średnia wieku uczestników badania wynosiła 32,36 lat, a wiek wahał się od 18 do 68 lat. Większość (23%) badanych była analfabetami, a 21,7% posiadało wykształcenie do poziomu szkoły podstawowej.
Tabela 1 przedstawia rozkład przypadków według objawów klinicznych odnotowanych w momencie rekrutacji pacjentów. Osłabienie, ból brzucha i anoreksja były najczęstszymi objawami związanymi z biegunką w przypadkach seropozytywnych HIV, podczas gdy ból brzucha, wymioty i gorączka były najczęstszymi skargami w grupie kontrolnej seronegatywnej HIV.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Spośród 154 seropozytywnych przypadków HIV, tylko 144 uczestników dostarczyło próbki kału. Większość (60,39%) przypadków seropozytywnych HIV miała przewlekłą biegunkę (Tabela 2), podczas gdy większość (72%) osób seronegatywnych HIV miała ostrą biegunkę.
|
||||||||||||||||||||||||||||
W tabeli 3 przedstawiono wyizolowane enteropatogeny w zależności od konsystencji stolca. Niektóre patogeny (C. parvum i I. belli) były częściej wykrywane w wodnistych stolcach, co okazało się istotne statystycznie (wartość P < 0,05), podczas gdy patogeny bakteryjne (C. difficile, biegunkowe E. coli i Shigella spp.) występowały istotnie częściej w stolcach uformowanych (wartość P < 0,05). Pasożyty z rodziny kokcydiów były najczęstszą przyczyną biegunki u osób seropozytywnych z HIV, przy czym C. parvum wykryto w 60,42% przypadków. Wśród patogenów bakteryjnych na czele listy znajdował się C. difficile, którego pozytywny wynik stwierdzono w 18,06% przypadków. Candida albicans została wyizolowana w 25,69% przypadków.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| * obliczenie wartości przy użyciu testu Kruskala-Wallisa. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
W tabeli 4 przedstawiono częstość patogenów jelitowych w zależności od statusu HIV badanych przypadków. Stwierdzono, że C. parvum, C. difficile i C. albicans występowały istotnie częściej w badanych przypadkach HIV-seropozytywnych niż w grupie kontrolnej HIV-negatywnej (wartość P < 0,05).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| * obliczenie wartości przy użyciu dokładnego testu Fishera. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ogółem wskaźnik izolacji patogenów powodujących biegunkę w HIV był wyższy u osób seropozytywnych z HIV z liczbą komórek CD4 mniejszą niż 200 komórek/μL w porównaniu z osobami seropozytywnymi z liczbą komórek CD4 większą niż 200 komórek/μL. Jednak wskaźnik izolacji był znacząco wyższy dla C. parvum, I. belli, C. difficile i C. albicans tylko (wartość P < 0,05) u pacjentów z liczbą komórek CD4 < 200 komórek/μL, jak pokazano w Tabeli 5.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| * obliczenie wartości przy użyciu dokładnego testu Fishera. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Dyskusja
Biegunka jest drugą główną przyczyną wizyt w szpitalu w krajach rozwijających się u pacjentów z HIV/AIDS . Etiologia biegunki w AIDS jest wieloczynnikowa. Oczekuje się, że etiologia zakaźna będzie wiodła prym w krajach rozwijających się, w przeciwieństwie do etiologii nieinfekcyjnej w krajach rozwiniętych. Istnieje wiele badań dotyczących czynników etiologicznych biegunki w HIV/AIDS z różnych części Północnych Indii. Jednak bardzo niewiele jest doniesień na temat patogenów biegunkowych izolowanych w przypadkach HIV/AIDS w odniesieniu do liczby limfocytów CD4 T i charakterystyki stolca z New Delhi. Nasze badanie ujawnia zakaźne czynniki etiologiczne biegunki u pacjentów z HIV/AIDS z najbardziej ruchliwego i największego szpitala w New Delhi, położonego w samym sercu miasta. Badanie to dotyczy również korelacji izolowanych czynników biegunkowych ze statusem seropozytywności HIV, charakterystyką stolca i liczbą limfocytów CD4 T.
Obecne badanie wykazuje przewagę przypadków męskich (112 mężczyzn z 154 przypadków) przy stosunku mężczyzn do kobiet wynoszącym 2,66 : 1, jak wykazały inne badania przeprowadzone na HIV-dodatnich przypadkach biegunki w Indiach. Przewaga przypadków męskich może wynikać z ich migracji do miast metropolitalnych (Delhi jest jednym z takich miast) w poszukiwaniu pracy. Pozostawanie z dala od współmałżonek przez dłuższy czas oraz promiskuityzm mężczyzn spowodowały nabycie przez nich infekcji HIV. Ponadto, przewaga mężczyzn mogła wynikać z faktu, że w istniejącym w Indiach środowisku społecznym kobiety nie szukają opieki medycznej, obawiając się ostracyzmu i utraty wsparcia rodziny. Średni wiek uczestników naszego badania wynosił 32,36 lat, a najczęstszą grupą wiekową były osoby w wieku 26-35 lat. Ta część populacji jest bardziej dotknięta problemem, ponieważ jest bardziej aktywna seksualnie. Podobne wyniki uzyskano w badaniu z południowych Indii, gdzie mediana wieku seropozytywnych nosicieli HIV z biegunką wynosiła 34 lata, a średnia wieku 36 lat.
Stwierdziliśmy, że pasożyty jelitowe są najczęstszymi patogenami jelitowymi związanymi z biegunką w populacji północnoindyjskiej HIV-pozytywnej. Badanie z Chennai również dokumentuje częstość występowania pasożytów jelitowych u pacjentów z HIV z biegunką. Profil mikrobiologiczny zaobserwowany w naszych seropozytywnych przypadkach jest typowy dla tego, co zostało opisane w innych indyjskich badaniach, jelitowe pasożyty kokcydialne są najczęstszymi izolowanymi patogenami jelitowymi, wśród których C. parvum był najczęstszy (60,42% przypadków). Wskaźnik pozytywności Cryptosporidium u pacjentów HIV-pozytywnych z biegunką był opisywany przez różnych autorów indyjskich w zakresie od 5,71% do 22,8%. Znacznie wysoka pozytywność Cryptosporidium w naszym badaniu może być spowodowana użyciem więcej niż jednej metody wykrywania Cryptosporidium, na przykład zmodyfikowanej metody Kinyouna i ELISA. Może to również wynikać z faktu, że większość naszych przypadków miała wodniste i półpłynne stolce. Różnice geograficzne i sezonowe również mają wpływ na występowanie tego pasożyta. Cryptosporidium powoduje obfitą i wodnistą biegunkę u pacjentów z AIDS i może powodować utratę płynów nawet do 10 litrów dziennie. Małe, odporne na warunki środowiskowe oocysty, niska dawka infekcyjna (10-100 oocyst) i oporność oocyst na środki dezynfekcyjne to niektóre z czynników wpływających na epidemiologię zarażenia Cryptosporidium. Ponieważ nie ma skutecznego lekarstwa na kryptosporydiozę, zwłaszcza u osób z obniżoną odpornością, rokowanie w jej przypadku jest zazwyczaj złe. Wskaźnik izolacji Cyclospora (1,39%) i Microsporidia (0,69%) był dość niski w niniejszym badaniu. Przyczyną tak niskiej wykrywalności może być fakt, że patogeny te są rozsiewane sporadycznie i mogły nie być obecne w dostarczonych próbkach kału lub mogły zostać przeoczone przez niedoświadczonego mikroskopistę. W celu ich wykrycia zalecane jest wielokrotne badanie próbek kału. Metody diagnostyczne, takie jak transmisyjna mikroskopia elektronowa, histochemia, barwienie przeciwciałami immunofluorescencyjnymi oraz metody oparte na PCR powinny poprawić i uprościć ich wykrywanie w próbkach klinicznych. Niektórzy autorzy podawali niski odsetek Microsporidium (1,69%) i Cyclospora (1,69%), podczas gdy inni podawali wysoki odsetek (41% i 2,6%) z Indii. Ascaris lumbricoides był widziany w 5,56% naszych przypadków prawdopodobnie z powodu wydalenia w kale z powtarzającym się płukaniem treści jelitowej w biegunce. G. lamblia i E. histolytica zostały znalezione w 3.7% i 7.41% przypadków. Obecność tych pasożytów odzwierciedla niski poziom higieny środowiska i warunków sanitarnych. W naszym badaniu C. difficile był najczęstszym zidentyfikowanym patogenem bakteryjnym (18,06%). Wskazuje to na fakt, że C. difficile jest powszechnym patogenem jelitowym odpowiedzialnym za biegunkę u pacjentów zakażonych HIV, ponieważ są oni poddawani wielokrotnej antybiotykoterapii z powodu zakażeń oportunistycznych, a klinicyści powinni traktować ten patogen jako rozpoznanie różnicowe podczas poszukiwania przyczyny biegunki u pacjentów zakażonych HIV/AIDS, zwłaszcza w krajach rozwijających się, takich jak nasz, gdzie dostęp do antybiotyków jest nieuregulowany. Badania przeprowadzone w Nigerii wykazały, że częstość występowania infekcji C. difficile wynosiła 43% i 14% odpowiednio u pacjentów hospitalizowanych i ambulatoryjnych zakażonych HIV. W naszym badaniu C. albicans występował w 25,69% przypadków. Może to być spowodowane niską odpornością i częstym stosowaniem antybiotyków. Wysoki wskaźnik izolacji C. albicans (36%) w HIV-pozytywnych przypadkach z biegunką został zgłoszony w poprzednim badaniu z naszego oddziału w przeszłości .
C. parvum, C. difficile, i C. albicans były istotnie bardziej powszechne w grupie HIV-pozytywnej niż w HIV-negatywnej grupie kontrolnej (wartość P < 0,05). Sugeruje to, że stan upośledzenia odporności w AIDS sprawia, że PLWHA są bardziej podatni na takie zakażenia, a po ich ustąpieniu nie są w stanie zapobiec namnażaniu się lub usunąć czynnika zakaźnego. W naszym badaniu seropozytywne przypadki HIV z liczbą CD4 <200 komórek/μL miały wyższy wskaźnik zakażeń niektórymi patogenami, co okazało się statystycznie istotne, jak pokazano w Tabeli 5. Najczęstszymi z tych patogenów były oportunistyczne pasożyty przewodu pokarmowego, C. parvum i I. belli, które powodują zakażenie, gdy dochodzi do obniżenia poziomu układu odpornościowego, co można zaobserwować przy zmniejszającym się poziomie CD4. Odsetek izolacji zmniejszył się wraz ze wzrostem liczby komórek CD4 z powodu rekonstytucji immunologicznej obserwowanej po skutecznym podaniu HAART. Jest to zgodne z badaniem przeprowadzonym przez Tuli i wsp., którzy stwierdzili odwrotną zależność między wskaźnikami izolacji patogenów jelitowych a liczbą komórek CD4.
5. Wnioski
Prezentowane badanie ujawniło, że większość przypadków HIV-pozytywnych miała przewlekłą biegunkę, pasożyty kokcydiowe były głównymi patogenami obciążającymi przyczynę tej biegunki, a przypadki z wodnistymi stolcami miały wyższy wskaźnik wykrytych patogenów. Odsetek izolacji był również wyższy u osób z liczbą CD4 <200 komórek/μL.
Podsumowując, nasze badanie podkreśla znaczenie wczesnej diagnostyki patogenów jelitowych wywołujących biegunkę u chorych na HIV/AIDS, gdyż przyczyniłoby się to do znacznego zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności z nią związanej. Praca ta podkreśla również potrzebę stworzenia odpowiednich urządzeń diagnostycznych do identyfikacji organizmów jelitowych w próbkach kału i ich gotowości do udostępnienia w peryferyjnych ośrodkach zdrowia w naszym kraju, gdzie koncentruje się obciążenie chorobą HIV/AIDS. Jest to niezwykle istotne, ponieważ opóźnienie w transporcie próbek kału do odległych laboratoriów miejskich oraz brak motywacji ze strony nieświadomego pacjenta odgrywają główną rolę w śmiertelności przypadków związanych z tą chorobą.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować za pomoc techniczną udzieloną przez panią Kamlesh. Chcieliby również podziękować Dr. Sanjeev Saini za pomoc w analizie statystycznej.
.