Results
Imaging cAMP in the primary cilium of live cells using fluorescent biosensors presents several unique challenges. Po pierwsze, rzęski są małe i smukłe, wystają 2-10 µm ponad powierzchnię komórki; po drugie, chociaż nie są ruchliwe, podlegają przemieszczaniu w wyniku przepływu objętościowego w roztworze kąpielowym, a po trzecie, sygnały z rzęsek mogą być trudne do oddzielenia optycznie od fluorescencji tła emanującej z ciała komórki. Chociaż kilka reporterów cAMP ukierunkowanych na rzęski zostało opisanych wcześniej (19, 24, 25), staraliśmy się stworzyć biosensory ratiometryczne o lepszej jasności i wierności ukierunkowania. Po przetestowaniu wielu projektów, stwierdziliśmy, że najlepszą celność, jasność i czułość oferują sondy czwartej generacji oparte na Epac z laboratorium Keesa Jalinka (EpacH188 i wersja o wyższym powinowactwie, EpacH187) (26) w połączeniu z Arl13b, białkiem wysoce zlokalizowanym w rzęskach (27) (Rys. 1A). Czujniki zawierające receptor 5-HT6 dawały porównywalnie dobrą lokalizację jak sondy sprzężone z Arl13b; jednakże, jak omówiono poniżej, receptory 5-HT6 niezlokalizowane do rzęsek powodowały wzrost komórkowego cAMP z powodu dobrze znanej konstytutywnej aktywności tego GPCR (28).
cAMP w rzęskach komórek permeabilizowanych digitoniną. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w buforze intracellular-like uzupełnionym o ATP i GTP. (A) Komórki mIMCD3 wykazujące ekspresję 5-HT6-mCherry i Arl13b-H187 zlokalizowaną zarówno w komórce jak i w rzęskach nie reagowały na 10 µM 5-HT w ciele komórkowym lub w rzęskach po 2 min traktowania 20 μg/mL digitoniny (4 eksperymenty, 5 rzęsek). (B) Podobnie, reaktywność na odwrotnego agonistę, 1 µM SB742457, i następująca po nim odpowiedź na 5-HT6 została utracona zarówno w komórce jak i w cewce po 2 min traktowania 20 μg/mL digitoniny (3 eksperymenty, 3 rzęski). (C) Permeabilizacja digitoniną spowodowała zniesienie sygnału cAMP indukowanego 50 µM forskoliny w ciałach komórkowych, ale wzrost cAMP był wykrywalny w rzęskach; 1 mM IBMX indukowane inhibicją PDE nie zdemaskowało żadnego sygnału (n = 4 eksperymenty z 4 rzęskami/7 komórek). (D) Kotransfekcja AC3 nie zmieniła odpowiedzi na forskolinę. (E) Kwantyfikacja i porównanie odpowiedzi cAMP na forskolinę w ciałach komórkowych i w rzęskach; **P = 0.0002, ***P = 00019. Niebieskie ślady = ciało komórki, czerwone ślady = rzęski. Paski czasu: 3 min. Oś y to stosunek 480/535 nm.
Oczywistym wyjaśnieniem braku efektu w poprzednich eksperymentach było to, że cAMP nie gromadził się wystarczająco, aby być wychwyconym przez reporter. Jednakże, gdy ten sam eksperyment został powtórzony przy użyciu forskoliny do bezpośredniej aktywacji endogennych ACs (cyklaz adenylowych) obecnych w błonie rzęskowej, niewielka, ale konsekwentna akumulacja cAMP została wykryta w mikrośrodowisku cilium, ale nie w ciele komórkowym (Fig. 4 C i E, lewe wykresy słupkowe). Podobne wyniki uzyskano w komórkach wykazujących ekspresję AC3 (36) (ryc. 4 D i E, prawe wykresy słupkowe), która była zlokalizowana w rzęskach, gdy uległa ekspresji w komórkach mIMCD3 (Dodatek SI, ryc. S8). Zakładając, że permeabilizacja nie doprowadziła do utraty istotnych składników maszynerii sygnalizacyjnej GPCR, mała, ale wykrywalna zmiana po dodaniu forskoliny sugeruje, że powinno być możliwe rozdzielenie zależnych od GPCR sygnałów cAMP, gdyby miały one miejsce w rzęski. Dane te wskazują również, że błona rzęskowa komórek mIMCD3 pozostała nienaruszona po traktowaniu digitoniną.
Poprzednie dane pozostawiają nas z pytaniem, dlaczego GPCRs nie są kompetentne do produkcji cAMP po sekwestracji w cilium. Wcześniejsze badania wymieniały wejście Ca2+ przez błonę rzęskową jako ważny regulator organellowego cAMP dzięki obecności specyficznych dla rzęsek kanałów przewodzących Ca2+ (PKD2L1 i PKD2) oraz ACs regulowanych przez Ca2+ (AC1, 8, 5 i 6) (11, 16, 23, 32, 37). Wykazano, że pierwotne rzęski komórek mIMCD3 są siedliskiem inhibitorów Ca2+ AC5 i/lub AC6 (10). Dlatego uznaliśmy, że wysoka spoczynkowa i Ca2+ przepuszczalność rzęsek (38, 39) może odpowiadać za inaktywację AC sprzężonych z receptorem 5-HT6. Aby lepiej rozwiązać ten problem, ulepszyliśmy czujnik, zastępując sekwencję celującą Arl13b funkcjonalnym receptorem 5-HT6, aby skierować fuzję reportera cAMP-GPCR bezpośrednio do cilium (5-HT6-EpacH187). Zgodnie z danymi z Fig. 3I i 4C, gdy 5-HT był skierowany wyłącznie do cilium, nie dawał mierzalnego sygnału cAMP (Fig. 5A). Ekspozycja komórek na nominalnie wolne od Ca2+ roztwory nie ratowała odpowiedzi 5-HT w rzęskach (Fig. 5B), wskazując, że wejście Ca2+ przez błonę rzęskową nie tłumiło sygnału. Rozważaliśmy, że być może ekspresja 5-HT6 zmieniła rzęskową dystrybucję białka Gαs w komórkach mIMCD3, ale eksperymenty z barwieniem immunologicznym sugerowały, że tak nie jest (Dodatek SI, Fig. S9). Jednakże, gdy testowaliśmy efekt 5-HT w komórkach wstępnie traktowanych SAG (250 nM do 1 µM) w celu aktywacji receptorów Smo (40), byliśmy w stanie przywrócić responsywność receptora 5-HT6 na agonistę (Fig. 5C). Wrażliwość na odwrotnego agonistę była również widoczna, sugerując przywrócenie konstytutywnej aktywności (Fig. 5D).
Aktywacja szlaku jeżowego zwiększa odpowiedź cAMP zgłaszaną przez 5-HT6-Epac-H187 na 5-HT i dopaminę w pierwotnych rzęskach: (A) Zgodnie z danymi na ryc. 3I i 4C, komórki mIMCD3 nie odpowiadały na 10 µM 5-HT, gdy fuzja czujnik-receptor była ograniczona ściśle do błony rzęskowej (6 eksperymentów, 6 rzęsek). (B) Zmniejszenie wysokiego poziomu Ca2+ w rzęskach przez umieszczenie komórek w roztworze nominalnie wolnym od Ca2+ nie ratowało sygnalizacji cAMP stymulowanej przez 5-HT (5 eksperymentów, 6 rzęsek). (C) Po nocnym wstępnym traktowaniu 1 µM SAG, 5 z 6 rzęsek (6 eksperymentów) odpowiedziało na stymulację 5-HT (**P = 0.000992). (D) Wstępne traktowanie 1 µM SAG uratowało odpowiedź na 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2% poniżej linii podstawowej w stosunku do późniejszego wzrostu cAMP wywołanego przez 10 µM 5-HT; typowe dla 4 eksperymentów, 4 rzęski). (E) Wzrost cAMP w rzęskach NIH 3T3 (typowy dla 9 eksperymentów, 11 rzęsek) został wywołany przez 10 μM 5-HT. (F) Wstępne traktowanie przez noc z 1 μM SAG znacząco zwiększyło odpowiedź 5-HT (**P = 0,00034; 6 eksperymentów, 7 rzęsek). Przednocne wstępne traktowanie 10 μM cyklopaminy (Cyclo) miało nieistotny efekt (8 eksperymentów, 9 rzęsek, wykres słupkowy). (G i H) 100 nM somatostatyny (SST) osłabiało odpowiedź na 5-HT w rzęskach zawierających SSTR3-GFP z lub bez wstępnego traktowania SAG (G: 5 eksperymentów, 6 rzęsek; H: 2 eksperymenty, 5 rzęsek). (I i J) Wstępne traktowanie SAG zwiększa odpowiedź na dopaminę (DA) 10 nM (I: 4 eksperymenty, 4 rzęski, J: 4 eksperymenty, 6 rzęsek, **P = 0,002476). Niebieskie ślady – ciało komórki; czerwone ślady – rzęski. Paski czasu: 3 min. Oś y to stosunek 480/535 nm FRET. Wykresy słupkowe wskazują odpowiedź 5-HT lub DA jako procent odpowiedzi forskoliny/IBMX; słupki błędów przedstawiają SEM.
Poprzednie wyniki pozostawiły nas z pytaniem, czy nieoczekiwana, zależna od SAG regulacja receptora 5-HT6 wyrażona w komórkach mIMCD3 była typem komórki i / lub GPCR specyficzna. W przeciwieństwie do mIMCD3, stymulacja komórek 3T3 (Fig. 5E) i MEFs (Dodatek SI, Fig. S10A) z 5-HT spowodowała mierzalną zmianę stosunku, która była jednak znacznie wzmocniona po leczeniu SAG (Fig. 5F i Dodatek SI, Fig. S10B). Co ciekawe, antagonista receptora smootenowego, cyklopamina, która mogłaby mieć przeciwny efekt do SAG, nie zniosła stymulowanej przez 5-HT sygnalizacji cAMP w pierwotnych rzęskach komórek 3T3 (wykres słupkowy, Fig. 5F).
Używając tego systemu, byliśmy również w stanie ocenić zdolność rzęskowego GPCR sprzężonego z Gαi, SSTR3, do odwrócenia stymulowanych przez serotoninę sygnałów cAMP w cilium. Traktowanie komórek 3T3 koekspresjonujących SSTR3-GFP i 5-HT6-H187 somatostatyną odwróciło odpowiedzi 5-HT z powrotem do poziomu podstawowego w ciągu 2 min w obecności i nieobecności leczenia SAG (Fig. 5 G i H), wskazując na lokalną kontrolę funkcji 5-HT6. Następnie sprawdziliśmy, jak SAG wpływa na aktywność innego rzęskowego GPCR sprzężonego z Gαs, receptora dopaminowego D1R (5). D1R-EGFP był koekspresjonowany z 5-HT6-H187 w komórkach 3T3, a komórki z fluorescencją tylko w rzęskach zostały wyselekcjonowane. Dziesięć nanomoli dopaminy wytwarzało małe, ale mierzalne sygnały cAMP w komórkach kontrolnych (ryc. 5I), i ponownie, sygnał ten był znacznie wzmocniony po leczeniu SAG (ryc. 5J; podsumowane na wykresie słupkowym).