W zdecydowanej większości procedur IHC/ICC stosuje się utrwalanie tkanek i komórek przy użyciu utrwalaczy na bazie formaldehydu. Poniższy protokół opisuje technikę wytwarzania 4% roztworu formaldehydu w PBS. Najbardziej efektywny utrwalacz musi być określony doświadczalnie.
Ostrożność: Formaldehyd jest toksyczny. Proszę przeczytać MSDS przed rozpoczęciem pracy z tą substancją chemiczną. Rękawice i okulary ochronne powinny być noszone, a roztwory sporządzane wewnątrz dygestorium.
Proszę przeczytać protokół w całości przed rozpoczęciem.
Potrzebne odczynniki
- Deionizowana H2O
- HCl (rozcieńczony)
- NaOH (1 N)
- Proszek paraformaldehydu
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materiały
- Jednostki filtracyjne
- Szklane naczynia i pręt do mieszania (dedykowane do roztworu formaldehydu)
- Rękawice i ochrona oczu
- Płyta grzejna z mieszadłem magnetycznym
- Termometr
- Wentylowany kaptur
.
Procedura
- Dla 1 L 4% formaldehydu, dodać 800 mL 1X PBS do szklanej zlewki na płytce do mieszania w wentylowanym kapturze. Podgrzewać mieszając do temperatury około 60 °C. Uważać, aby roztwór nie zagotował się.
- Dodać 40 g proszku paraformaldehydu do ogrzanego roztworu PBS.
- Proszek nie rozpuści się natychmiast w roztworze. Powoli podnieść pH przez dodawanie 1 N NaOH kroplami z pipety, aż roztwór będzie klarowny.
- Po rozpuszczeniu paraformaldehydu roztwór powinien być schłodzony i przefiltrowany.
- Poprawić objętość roztworu do 1 L za pomocą 1X PBS.
- Sprawdzić pH i dostosować je za pomocą niewielkich ilości rozcieńczonego HCl do około 6.9.
- Roztwór może być podzielony na porcje i zamrożony lub przechowywany w temperaturze 2-8 °C do jednego miesiąca.
Różnica między paraformaldehydem, formaldehydem i formaliną
Paraformaldehyd (nazwa chemiczna to polioksymetylen) jest proszkiem spolimeryzowanego formaldehydu, który sam w sobie nie jest w stanie utrwalić tkanek. Aby paraformaldehyd mógł być użyty jako środek utrwalający tkanki, musi być rozpuszczony w gorącej wodzie, aby stał się roztworem formaldehydu. Formalina jest nasyconym roztworem formaldehydu w wodzie (37% wagowo, 40% objętościowo) zawierającym 10-15% metanolu. Metanol jest dodawany w celu spowolnienia polimeryzacji do formaldehydu, co zmniejsza siłę utrwalania formaliny. Formalina może być również wytwarzana w postaci bezalkoholowej ze sproszkowanego paraformaldehydu.
.