W zdecydowanej większości procedur IHC/ICC stosuje się utrwalanie tkanek i komórek przy użyciu utrwalaczy na bazie formaldehydu. Poniższy protokół opisuje technikę wytwarzania 4% roztworu formaldehydu w PBS. Najbardziej efektywny utrwalacz musi być określony doświadczalnie.

Ostrożność: Formaldehyd jest toksyczny. Proszę przeczytać MSDS przed rozpoczęciem pracy z tą substancją chemiczną. Rękawice i okulary ochronne powinny być noszone, a roztwory sporządzane wewnątrz dygestorium.

Proszę przeczytać protokół w całości przed rozpoczęciem.

Potrzebne odczynniki

  • Deionizowana H2O
  • HCl (rozcieńczony)
  • NaOH (1 N)
  • Proszek paraformaldehydu
  • 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4

Materiały

  • Jednostki filtracyjne
  • Szklane naczynia i pręt do mieszania (dedykowane do roztworu formaldehydu)
  • Rękawice i ochrona oczu
  • .

  • Płyta grzejna z mieszadłem magnetycznym
  • Termometr
  • Wentylowany kaptur

Procedura

  1. Dla 1 L 4% formaldehydu, dodać 800 mL 1X PBS do szklanej zlewki na płytce do mieszania w wentylowanym kapturze. Podgrzewać mieszając do temperatury około 60 °C. Uważać, aby roztwór nie zagotował się.
  2. Dodać 40 g proszku paraformaldehydu do ogrzanego roztworu PBS.
  3. Proszek nie rozpuści się natychmiast w roztworze. Powoli podnieść pH przez dodawanie 1 N NaOH kroplami z pipety, aż roztwór będzie klarowny.
  4. Po rozpuszczeniu paraformaldehydu roztwór powinien być schłodzony i przefiltrowany.
  5. Poprawić objętość roztworu do 1 L za pomocą 1X PBS.
  6. Sprawdzić pH i dostosować je za pomocą niewielkich ilości rozcieńczonego HCl do około 6.9.
  7. Roztwór może być podzielony na porcje i zamrożony lub przechowywany w temperaturze 2-8 °C do jednego miesiąca.

Różnica między paraformaldehydem, formaldehydem i formaliną

Paraformaldehyd (nazwa chemiczna to polioksymetylen) jest proszkiem spolimeryzowanego formaldehydu, który sam w sobie nie jest w stanie utrwalić tkanek. Aby paraformaldehyd mógł być użyty jako środek utrwalający tkanki, musi być rozpuszczony w gorącej wodzie, aby stał się roztworem formaldehydu. Formalina jest nasyconym roztworem formaldehydu w wodzie (37% wagowo, 40% objętościowo) zawierającym 10-15% metanolu. Metanol jest dodawany w celu spowolnienia polimeryzacji do formaldehydu, co zmniejsza siłę utrwalania formaliny. Formalina może być również wytwarzana w postaci bezalkoholowej ze sproszkowanego paraformaldehydu.

.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.