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Risultati e discussione

La coniugazione di Spirogyra è stata segnalata per essere indotta da una riduzione o esaurimento del contenuto di azoto (Grote 1977; Yamashita e Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Pertanto, abbiamo prima cercato di indurre la coniugazione riducendo l’azoto dal mezzo di coltura. Tuttavia, questo non ha avuto successo. Grote (1977) ha riferito che la coniugazione è stata indotta in un mezzo inorganico puro di closterium e che il valore del pH era importante. Anche se abbiamo incubato i filamenti algali nel mezzo di vari pH, la coniugazione non è stata indotta. Inoltre, altre prove, varie temperature e impoverimento di vari nutrienti, non hanno avuto successo. È stato riportato che la coniugazione è stata indotta incubando i filamenti algali sotto illuminazione continua in alcune specie di Spirogyra (Yamashita e Sasaki 1979). Tuttavia, i nostri materiali non hanno mostrato coniugazione, anche quando i filamenti sono stati incubati senza fonte di azoto sotto illuminazione continua per 2 settimane. Dopo varie prove, siamo finalmente riusciti a indurre la coniugazione incubando i filamenti su una piastra di agar preparata con APW a 23°C sotto un ciclo L-D di 12:12 ore per 4 giorni. Durante l’incubazione, all’estremità distale delle cellule terminali si è formato anche un rizoide a forma di asta. Quando i filamenti sulla piastra di agar sono stati incubati al buio, il fenomeno della coniugazione non è stato indotto. Allen (1958) ha riportato che la coniugazione era indotta dall’incubazione su piastra di agar. Ha mantenuto una coltura di stock utilizzando il terreno-acqua di Pringsheim (Pringsheim 1946) sotto un regime di 16 ore di luce (tubo fluorescente bianco freddo) – 8 ore di buio a circa 20°C. Per l’induzione dell’accoppiamento, alcuni filamenti sono stati trasferiti su agar Difco 1,5% preparato con acqua distillata e incubato a circa 20°C sotto un ciclo L-D di 16:8 h. Dopo un’incubazione di alcuni giorni, le zigospore si sono formate sulla piastra di agar. Anche se le condizioni di luce e la temperatura durante l’incubazione erano diverse, il metodo di Allen (1958) era fondamentalmente lo stesso del nostro metodo. Abbiamo ulteriormente analizzato i fattori responsabili dell’induzione della coniugazione sulla piastra di agar, come segue.

Ci siamo chiesti se qualche contaminante sconosciuto contenuto nella polvere di agar fosse responsabile dell’induzione della coniugazione. Abbiamo esaminato questa possibilità con il seguente esperimento. La polvere di agar (Wako, Osaka, Giappone) è stata sospesa in APW e tenuta a 4°C sotto agitazione per una notte. Dopo la centrifugazione (185×g, 10 min), il pellet risultante è stato lavato 2 volte con APW per centrifugazione. Il pellet di agar finale è stato sospeso in APW fresco e sono state preparate le piastre. La coniugazione è stata indotta con successo su questa piastra di agar. Quando i filamenti algali sono stati incubati nel surnatante ottenuto dal lavaggio della polvere di agar, la coniugazione non è stata indotta affatto (dati non mostrati). Quindi, l’incubazione sulla piastra di agar ma non il contaminante solubile era responsabile dell’induzione della coniugazione.

Siccome APW non contiene sostanze chimiche azotate, la piastra di agar dovrebbe contenere poco o niente azoto. Pertanto, era possibile che entrambi i fattori, la posizione sulla piastra di agar e l’esaurimento dell’azoto, lavorassero sinergicamente nell’induzione. Per esaminare questa possibilità, abbiamo incubato i filamenti sulla piastra di agar preparata con APW integrato con 1 mM KNO3. Su questa piastra di agar, la coniugazione è stata anche indotta (Fig. 1a), indicando che la deplezione di azoto non è responsabile dell’induzione della coniugazione. Inoltre, la coniugazione è stata indotta quando i filamenti sono stati incubati su una piastra di agar preparata utilizzando il mezzo closterium, che conteneva vari nutrienti (Fig. 1b). Questi risultati hanno indicato inequivocabilmente che la posizione sulla piastra di agar di per sé è un fattore responsabile per l’induzione della coniugazione.

L’induzione della coniugazione su piastra di agar è stata esaminata in altre specie, S.fuluviatilis, che ha differenziato il rizoide al taglio dei filamenti algali (dati non mostrati) come nel caso di S. castanacea. In questa specie, la coniugazione è stata indotta anche su incubazione su piastra di agar preparata con APW. Abbiamo ulteriormente esaminato la coniugazione su piastra di agar in tre Spirogyra, che non hanno differenziato il rizoide. S.ellipsospora Transeau è stata mantenuta in laboratorio come contaminante della cultura di Chara. Altre due Spirogyra sp. raccolte dal lago Biwa sono state mantenute come cultura assenica per 6 mesi. Tutte e tre le Spirogyra non hanno mostrato coniugazione mediante incubazione su piastra di agar.

In alcune specie di Spirogyra, la coniugazione è stata indotta da una diminuzione o esaurimento del contenuto di azoto (Grote 1977; Yamashita e Sasaki 1979; Simons et al. 1984). Oltre al contenuto di azoto, l’intensità della luce e/o il pH dovevano essere controllati in S. majuscule (Grote 1977). In S. castanacea e S. fuluviatilis, l’incubazione su piastra di agar è stata efficace e l’esaurimento dell’azoto non è stato necessario (presente studio). D’altra parte, Agrawal e Singh (2002) hanno riportato che Spirogyra sp. non ha iniziato la coniugazione sulla piastra di agar 2-10%. Questo era simile ai nostri risultati ottenuti in Spirogyra sp., che non ha differenziato il rizoide. Quindi, i fattori necessari per l’induzione della coniugazione sono molto variabili tra le specie di Spirogyra. Ci siamo chiesti se l’inibizione della crescita fosse responsabile dell’induzione della coniugazione su piastra di agar. Durante l’incubazione sulla piastra di agar preparata utilizzando sia APW che closterium medium, le cellule hanno proliferato tramite divisione cellulare su entrambe le piastre di agar quando le cellule non hanno iniziato la formazione della papilla del tubo di coniugazione. Quindi, l’inibizione della crescita non era un fattore scatenante della coniugazione.

Per esaminare la presenza del tipo di accoppiamento tra i filamenti, la cultura monoclonale di S. castanacea è stata sottoposta all’induzione della coniugazione. Dopo 48 ore di incubazione, due tipi di coniugazione sono stati trovati nello stesso filamento (Fig. 2a-c). La figura 2b mostra le cellule che hanno indotto la coniugazione scalare (punta di freccia in Fig. 2a). D’altra parte, la Fig. 2c mostra le cellule che inducono la coniugazione laterale (freccia in Fig. 2a). Le zigospore si sono formate normalmente dopo la coniugazione laterale (Fig. 2d). Yamagishi (1977) ha riferito che la coniugazione scalare è generalmente osservata, mentre quella laterale era raramente in S.castanacea. Il nostro risultato è coerente con quello di Yamagishi (1977). Tuttavia, entro un limite della nostra conoscenza, l’induzione di entrambe le coniugazioni scalare e laterale in uno stesso filamento (Fig. 2a) è la prima relazione. Quando due filamenti si accoppiavano, tutte le cellule di un filamento si comportavano come maschi e quelle dell’altro filamento come femmine nella maggior parte dei casi. Molto raramente, tuttavia, le zigospore si sono formate in entrambi i filamenti (Fig. 3). Così, il tipo di accoppiamento non è fisso almeno in S.castanacea. L’ipnozigote si è formato con l’incubazione sulla piastra di agar per circa 1 mese. Tuttavia, è stato difficile indurre in modo riproducibile la germinazione con l’aggiunta di closterium medium. Bisogna trovare un metodo per indurre in modo riproducibile la germinazione.

Abbiamo esaminato l’identificazione dei materiali extracellulari secreti durante il processo di accoppiamento usando varie lectine in S. castanacea. Tra le 19 lectine esaminate (BSL-I, BSL-II, Con A, DBA, DSL, ECL, jacalin, LEL, PHA-E, PHA-L, PNA, PSA, RCA I, SBA, SJA, STL, UEA I, VVL e WGA), BSL-1, Con A, jacalin, RCA-I e SBA coloravano le cellule riproduttive ma non quelle vegetative (Tabella 1). Yoon et al. (2009) hanno riportato che tre lectine, Con A, RCA e UEA, hanno mostrato una notevole etichettatura sui materiali extracellulari in S. varians (Hassall) Kützing. Quindi, i materiali leganti la lectina secreti durante la coniugazione sembrano diversi in una certa misura tra le specie. Abbiamo precedentemente segnalato che BSL-I e jacalin mostrato modelli contrastanti macchia nel rizoide: jacalin chiaramente macchiato il contorno del rizoide, mentre la colorazione con BSL-I era diffusa (Inoue et al. 1999, Ikegaya et al. 2008b). È stato suggerito che il materiale legante BSL-I fosse responsabile dell’adesione dei filamenti al substrato. D’altra parte, il materiale legante jacalin è stato ipotizzato di essere coinvolto nel riconoscimento del substrato (Ikegaya et al. 2008b). Nel presente studio, quindi, abbiamo concentrato la nostra attenzione su BSL-I e jacalin (Fig. 4). Dopo 48 ore di incubazione su piastra di agar, un filamento mostrato in Fig. 4a ha formato papille in varie direzioni. È stato ipotizzato che questo filamento ha iniziato la formazione di papille in assenza del filamento partner. BSL-I ha fortemente colorato la superficie delle papille. Anche i setti tra le cellule erano fortemente colorati. Successivamente, abbiamo colorato una coppia di filamenti che hanno iniziato la coniugazione dopo 48 ore di incubazione. In Fig. 4b, è stato giudicato che il filamento superiore era un gamete maschile e quello inferiore era un gamete femminile, rispettivamente, poiché il diametro delle cellule inferiori del filamento diventa più grande di quelle del filamento superiore. I tubi di coniugazione allungati dalle cellule appaiate erano fortemente macchiati, mentre l’intera superficie cellulare del gamete femminile era debolmente macchiata (Fig. 4b′). Dopo 72 ore di incubazione, l’intera superficie cellulare del gamete maschile era anche debolmente colorata (Fig. 4c′). Dopo 96 ore di incubazione su piastra di agar, si sono formate le zigospore (Fig. 4d). I tubi di coniugazione erano fortemente colorati (Fig. 4d′), mentre la superficie delle zigospore non era colorata. Successivamente, è stata esaminata la colorazione con jacalin. Le cellule dei filamenti in Fig. 3e formavano papille nella stessa direzione. Abbiamo ipotizzato che questo filamento ha iniziato la coniugazione in presenza di un filamento partner ed è stato perso durante il trasferimento sul vetro del vetrino. Le papille erano fortemente colorate con jacalina (Fig. 4e′). Durante il processo di coniugazione, la jacalina ha colorato principalmente i canali di coniugazione (Fig. 4f′-h′). Il modello di colorazione con Con A, RCA-I e SBA è stato anche esaminato (dati non mostrati). Con A ha fortemente colorato i setti tra le zigospore formate nel gamete femminile, mentre le papille erano molto debolmente. Quando zigospore erano formati, il modello di colorazione con RCA-I o SBA era simile a quello di BSL-I come mostrato in Fig. 4d′.

Esaminiamo l’effetto di sei lectine, BSL-I, Con A, jacalin, RCA-I, SBA, e WGA, sulla coniugazione. I filamenti sono stati pre-incubati in APW integrato con una delle lectine per 1 giorno. Poi, sono stati trasferiti su una piastra di agar integrata con la stessa lectina e incubati per 4 giorni. Si è scoperto che la jacalina ha inibito gravemente la formazione di zigospore, ma gli altri non l’hanno fatto (dati non mostrati). L’analisi sistematica ha mostrato che jacalin ha inibito gravemente il passo dell’inizio; inizio della formazione della papilla (Fig. 5). Successivamente, è stata esaminata la reversibilità dell’inibizione da parte di jacalin. I filamenti sono stati successivamente incubati in APW integrato con jacalin per 1 giorno e poi in APW senza jacalin per 1 giorno. Poi, sono stati incubati su una piastra di agar priva di jacalina per 4 giorni. Tuttavia, la papilla non si è formata affatto. Questa inibizione irreversibile potrebbe essere causata dal forte legame di jacalin. Yoon et al. (2009) hanno riportato che RCA e UEA hanno inibito la coniugazione. Tuttavia, non hanno identificato la fase dell’inibizione. Anche se BSL-I, RCA-I, Con A e SBA hanno colorato il tubo di coniugazione, non ne hanno inibito la formazione. Il ruolo dei materiali riconosciuti da BSL-I, RCA-I o SBA è l’obiettivo di studi futuri.

Randhawa (1959) ha suggerito la somiglianza dei processi di coniugazione e la formazione di rizoidi: lo stimolo di contatto è coinvolto. D’altra parte, Kniep (1928) riteneva che i processi di coniugazione fossero essenzialmente dovuti a uno stimolo chimico (citato in Randhawa (1959)). Sia il tubo di coniugazione che il rizoide iniziano attraverso la formazione della papilla e possono allungarsi attraverso la crescita della punta. Tuttavia, il tubo di coniugazione si forma sul fianco ma il rizoide si forma all’estremità distale della cellula (Nagata 1973). Jacalin ha chiaramente colorato il contorno del tubo di coniugazione (Fig. 3e′-h′) e del rizoide (Ikegaya et al. 2008b). Jacalin non ha inibito la formazione di rizoide, ma inibito la differenziazione per essere rizoide a forma di rosetta (Ikegaya et al. 2008b). Nel caso di tubi di coniugazione, tuttavia, jacalin inibito la formazione di papilla di per sé (Fig. 5). Sembra che il ruolo del materiale legante la jacalina sia diverso nel tubo di coniugazione e nel rizoide.

Il successo nell’induzione riproducibile della coniugazione in laboratorio ha aperto la strada ad analisi sistematiche della coniugazione in Spirogyra, come il meccanismo di determinazione della sessualità delle cellule, il ruolo dei materiali leganti la lectina, il meccanismo di movimento del protoplasto maschile.