La stragrande maggioranza delle procedure IHC/ICC impiega la fissazione di tessuti e cellule utilizzando fissativi a base di formaldeide. Il protocollo seguente descrive la tecnica per generare una soluzione di formaldeide al 4% in PBS. Il fissativo più efficace deve essere determinato sperimentalmente.
Attenzione: La formaldeide è tossica. Si prega di leggere la scheda di sicurezza prima di lavorare con questa sostanza chimica. Guanti e occhiali di sicurezza dovrebbero essere indossati e le soluzioni fatte all’interno di una cappa aspirante.
Si prega di leggere il protocollo nella sua interezza prima di iniziare.
Reagenti richiesti
- H2O deionizzata
- HCl (diluito)
- NaOH (1 N)
- Paraformaldeide in polvere
- 1X PBS: 0,145 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0081 M Na2HPO4, 0,0015 M KH2PO4, pH 7.4
Materiali
- Unità di filtraggio
- Vetri e barra di agitazione (dedicata alla soluzione di formaldeide)
- Guanti e protezione per gli occhi
- Piastra calda con agitatore magnetico
- Termometro
- Cappuccio ventilato
Procedura
- Per 1 L di Formaldeide 4%, aggiungere 800 mL di PBS 1X in un becher di vetro su una piastra di agitazione in una cappa ventilata. Riscaldare mentre si agita a circa 60 °C. Fare attenzione che la soluzione non bolla.
- Aggiungere 40 g di polvere di paraformaldeide alla soluzione PBS riscaldata.
- La polvere non si scioglierà immediatamente nella soluzione. Alzare lentamente il pH aggiungendo 1 N NaOH a goccia da una pipetta fino a quando la soluzione si schiarisce.
- Una volta che la paraformaldeide è dissolta, la soluzione deve essere raffreddata e filtrata.
- Regolare il volume della soluzione a 1 L con 1X PBS.
- Controllare il pH, e regolarlo con piccole quantità di HCl diluito a circa 6.9.
- La soluzione può essere aliquotata e congelata o conservata a 2-8 °C per un massimo di un mese.
La differenza tra paraformaldeide, formaldeide e formalina
La paraformaldeide (nome chimico è poliossimetilene) è una polvere di formaldeide polimerizzata che da sola non può fissare i tessuti. Per essere utilizzabile come fissatore di tessuti, la paraformaldeide deve essere dissolta in acqua calda per diventare una soluzione di formaldeide. La formalina è una soluzione satura di formaldeide in acqua (37% in peso, 40% in volume) contenente 10-15% di metanolo. Il metanolo viene aggiunto per rallentare la polimerizzazione in formaldeide, che riduce il potere di fissaggio della formalina. La formalina può anche essere fatta in una forma senza alcool dalla paraformaldeide in polvere.