Abstract
Os mecanismos de acetilação de vários substratos típicos seleccionados de experiências, incluindo arylaminas e arylhydrazinas, são investigados com a teoria funcional da densidade neste artigo. Os resultados indicam que todos os estados de transição são caracterizados por uma estrutura anelar de quatro membros, sendo a hidralazina (HDZ) o substrato mais potente. A bioatividade de todos os compostos é aumentada em uma seqüência de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ. O efeito conjunto e a deslocalização dos pares solitários de N átomo desempenham um papel fundamental na reacção. Todos os resultados são consistentes com os dados experimentais.
1. Introdução
As N-acetiltransferases de arilamina (NATs, EC 2.3.1.5) são enzimas metabólicas de fase II encontradas tanto em procariotas como em eucariotas . A reação de N-acetilação leva à desintoxicação dos xenobióticos arilamina e finalmente direciona para íons arilnitrenos eletrofílicos, que são considerados responsáveis pela formação de adutos de DNA . Para os humanos, as duas isozimas funcionais NAT, NAT1 e NAT2, mostram grandes diferenças na especificidade do substrato e na distribuição dos tecidos, apesar da identidade da sequência de 81% de aminoácidos. Esta última, NAT2, é expressa predominantemente em epitélio hepático e intestinal . Estudos anteriores supõem que os NATs catalisam uma transferência de acetil por um mecanismo cinético clássico do ping-pong (Esquema 1). A análise de mutagênese dirigida ao local de NAT2 humano e Salmonella typhimurium NAT (StNAT) sugeriu que um resíduo de cisteína no local ativo foi responsável por mediar o processo de acetilação. Um recente estudo cinético de pré-estado e estado estável sobre acetato de p-nitrofenilo (PNPA) e NAT2 revelou que o mecanismo catalítico do NAT2 poderia depender da formação de um par thiolate-imidazolium. Embora a enzima seja encontrada tanto em eucariotas quanto em procariotas, os papéis endógenos dos NATs ainda não estão claros. A determinação do substrato revelou que tanto as arilaminas quanto as arilidrazinas poderiam ser acetiladas por NATs . Os passos necessários na reação de transferência de acetil são compostos pela transferência do grupo acetil do resíduo de cisteína do local ativo para o substrato, e pela remoção de um próton do último para o primeiro. Neste trabalho, um estudo teórico detalhado sobre os comportamentos dos substratos de arilaminas e arilidrazinas na acetilação está disponível, incluindo as propriedades de suas estruturas, os estados de transição, os perfis das energias.
2. Metodologias
Todos os cálculos foram realizados com o método da teoria funcional da densidade (DFT) B3LYP como implementado no pacote do programa Gaussian03 , que foi anteriormente empregado com sucesso em vários sistemas enzimáticos . Quando foram usados conjuntos de bases 6-31G* e 6-311+G (3df, 2p), o método funcional híbrido B3LYP foi preferido aos métodos Hartree-Fock (HF) e MP2 . Embora por vezes falhe no tratamento de interacções ricas em dispersão, o método B3LYP tem sido aplicado com sucesso em muitos sistemas biológicos .
As geometrias de todos os reagentes, intermediários e produtos são optimizadas ao nível da teoria B3LYP/6-31G*. As conformações mais estáveis, bem como as suas energias em todos os estados de equilíbrio e de transição, foram calculadas. Os cálculos de frequência são efectuados para todos os pontos estacionários resultantes e cada estado de transição tem apenas uma frequência imaginária. Além disso, o método MP2/6-311+G** é empregado nas estruturas otimizadas dos pontos estacionários para obter perfis energéticos mais precisos. Se não for especialmente apontado, todas as análises de energia seguintes referem-se aos resultados de MP2/6-311+G**//B3LYP/6-31G (d) cálculos.
3. Resultados e Discussão
3.1. Os Óbitos de Fronteira dos Substratos
Six substratos, ácido p-aminobenzóico(PABA), 4-metoxilanilina(4-MA), 4-aminosalicilato (4-AS), 5-aminosalicilato(5-AS), isoniazida(INZ), hidralazina (HDZ), são selecionados de acordo com as referências , que podem ser divididas em duas famílias distintas: arilaminas e aril-hidrazinas. As energias para os óbitos fronteiriços (incluindo HOMO-2, HOMO-1, HOMO, LUMO, LUMO+1 e LUMO+2) de todos os seis substratos estão listados na Tabela 1, que são considerados como desempenhando papéis importantes nos sistemas bioenzimáticos . Para as arilaminas, as energias HOMO são reduzidas numa sequência de 4-MA > 5-AS > PABA > 4-AS, o que indica o aumento da sua reactividade nucleófila. Entre todos os seis substratos (ver Figura 1 nos materiais suplementares disponíveis online em doi: 10.1155/2009/783035), INZ tem o maior gap energético entre HOMO e LUMO, o que sugere a sua estabilidade. Os resultados da Análise da População Natural (NPA) mostraram que os átomos ativos do amino N para a família das arilaminas são mais electronegativos do que os do grupo das hidrazinas, o que é causado principalmente pelo efeito conjugado.
As PABA e 4-AS têm diferentes substituições no local p do grupo amino amino no anel de seis membros, as suas bioactividades são quase as mesmas. Uma ligação intermolecular H estabilizará o próprio substrato com a queda de energia cerca de 19-21 kJ/mol. Tanto a energia HOMO como a LOMO para 5-AS são superiores às de 4-A𝑆s, sugerindo que a primeira é mais reactiva do que a segunda.
Para os substratos de aril-hidrazinas, o par solitário dos átomos N na espinha dorsal do anel de seis membros será deslocalizado para todo o sistema de modo a aumentar a sua estabilidade. Os valores de HDZ 𝐸(𝐿-𝐻)são 0,0318 a.u. superiores aos de INZ, indicando uma maior reatividade do que estes últimos.
3,2. Os diferentes caminhos e estados de transição
Em princípio, todos os substratos podem reagir com o resíduo de cisteína do local ativo através de um caminho concertado ou um passo a passo. Aos primeiros, os estados de transição (ver Figuras 1 e 2, con-ts) experimentam uma transferência concertada do átomo de hidrogênio H5 para S1 de cisteína e uma formação de ligação entre os átomos N4 e C2. A quebra das ligações antigas (N4H5 e S1C2) e a formação de novas ligações (C2N4 e S1H5) ocorrem simultaneamente. Os reagentes e os produtos alvo são ligados pelo único estado de transição na superfície energética potencial (PSA). Os principais dados estruturais de todos os estados de transição estão listados na Tabela 1 dos materiais suplementares. Para o mecanismo por etapas, o átomo H5 será primeiramente transferido para o átomo O3 do grupo carbonilo, tendendo a gerar uma nova ligação entre o átomo N4 e C2 através do estado de transição stw-ts1. Em seguida, um thiolester intermediário (intmed) será formado. Consequentemente, a segunda migração do H5 do grupo hidroxila para o átomo S1 via stw-ts2, juntamente com a ruptura da ligação S1-C2, que finalmente irá direcionar para os produtos.
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A estrutura dos estados de transição tanto para o percurso concertado como para o percurso escalonado do PABA.
Os resultados indicam que todos os estados de transição são caracterizados por uma estrutura de anéis com quatro membros, que é quase plana. Há dois pequenos ângulos inferiores a 80° em cada estado de transição (C2S1H5 e S1C2N4 para con-ts, C2O3H5 e C2N4H5 para stp-ts1, C2S1H5 e S1C2O3 para stp-ts2), o que traz grande tensão a todo o sistema e o torna instável. Entre os seis estados de transição concertada (con-ts) de todos os substratos, as propriedades da ligação C2N4, N4H5 e S1H5 são aproximadamente as mesmas para todos os substratos, enquanto a interação entre S1 e C2 é um dos fatores determinantes para a etapa concertada.
As coisas tornam-se diferentes para os percursos dos passos. As alterações de hibridação do átomo C2 seguem uma tendência semelhante (𝑠𝑝3→𝑠𝑝2→𝑠𝑝3) para todos os substratos durante a acetilação por passos (Tabela 1 suplementar). A primeira migração de H5 levará ao estado de transição stp-ts1, e então um intermediário denominado intmed está localizado na superfície energética potencial (PSA), que é um mínimo local. É um intermediário tetraédrico thiolester, como proposto em estudos experimentais anteriores. É de curta duração e uma transferência de H5 conseqüente logo ocorrerá via stp-ts2 de estado de transição. Para o percurso por etapas, as estruturas dos estados de tração para diferentes substratos diferem muito pouco com outras. As estruturas em 3D dos estados de transição foram listadas para PABA (Figura 2), as outras foram semelhantes àquelas.
3.3. As Energias
As energias relativas de todas as vias possíveis para os seis substratos são realizadas com base na soma das energias dos reagentes tomadas como zero (Figura 3). A partir da Figura 3, verificamos que as vias concertadas são favorecidas em relação às vias escalonadas. As barreiras energéticas dos estados de transição concertados (con-ts) são inferiores às dos estados stepwise (stp-ts1) na faixa de 83,5 kJ/mol a 26,9 kJ/mol (Tabela 2 suplementar). As arylhydrazines são melhores substratos do que as arylamines, e HDZ é o mais reactivo com a menor energia de activação, o que satisfaz os dados experimentais com boa concordância . Esta conclusão também poderia ser extraída da análise dos dados da estrutura (Tabela 1 suplementar). O efeito de conjunção melhorado e a deslocalização dos pares solitários de nitrogênio na espinha dorsal estabilizou o estado de transição. A bioactividade de todos os substratos é aumentada numa sequência de PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ.
Os perfis energéticos para todos os substratos.
4. Conclusões
As seguintes conclusões podem ser tiradas.
(i)Todos os substratos podem ser acetilados por duas vias diferentes: a concertada e a escalonada, sendo a primeira muito preferida devido às menores energias de activação.(ii)A partir do nosso cálculo, as arylhydrazinas são melhores substratos do que as arylaminas, sendo a HDZ a mais reactiva com a menor energia de activação. A bioactividade de todos os substratos é aumentada numa sequência como PABA≈4-AS<4-MA<5-AS≈INH<HDZ, o que é consistente com os resultados experimentais muito bem. (iii)O efeito de conjunção e os pares solitários deslocalizados desempenham papéis muito importantes na acetilação. O efeito de conjunção e o número crescente de pares solitários no anel de seis membros levará a uma menor barreira energética.
Conhecimento
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Scientific Foundation of China (no.20603030, no.20873074, e no.10674114).), 973 projecto do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (n.º 2009CB930103), a Fundação Científica Natural da Província de Shandong (n.º Q2008B07), e a Fundação para Grupos de Investigação Criativa da Universidade de Ludong (n.º 08-CXA001).
Materiais Suplementares
Para a limitação do comprimento deste trabalho, as estruturas 3D de todos os substratos de arilaminas e arilidrazinas, os dados da estrutura principal para todos os estados de transição e as energias relativas para diferentes caminhos foram reunidos nos materiais suplementares.
- Material Suplementar