Free Press

Introducere

Pentru a asigura o hrană și o nutriție adecvată pentru populația globală care se așteaptă să ajungă la 9 miliarde de oameni până în 2050 (http://www.unpopulation.org), randamentul orezului trebuie să crească cu cel puțin 60% (FAO 2009). Orezul este alimentul de bază pentru mai mult de jumătate din populația lumii, iar această populație consumatoare de orez crește cu o rată de 1,098% pe an (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Escaladarea populației înseamnă o cerere mai mare de alimente, apă și terenuri, în condițiile în care baza de resurse naturale pentru agricultură este degradată, deoarece suprafețe mari de terenuri agricole sunt deturnate de la producția de alimente către industrializare și producția de biocombustibili. O schimbare climatică imprevizibilă amenință să reducă și mai mult terenurile viabile din punct de vedere agricol din cauza creșterii numărului de cazuri de secetă și inundații (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Pe măsură ce populația în creștere și schimbările climatice globale exercită o presiune tot mai mare asupra aprovizionării cu alimente la nivel mondial, este esențial să continuăm să îmbunătățim performanța culturilor în ceea ce privește productivitatea cerealelor pentru a ține pasul cu creșterea populației. Creșterea productivității culturilor, conferită de tipurile de plante create în perioada revoluției verzi, a susținut boom-ul demografic de după cele două războaie mondiale. De atunci, în ciuda utilizării unor soiuri îmbunătățite și a tehnologiilor avansate, potențialul de randament al culturilor actuale de orez s-a îmbunătățit doar puțin, ceea ce indică faptul că aceste soiuri au atins un plafon de randament (Akita 1994). Recent, se încearcă creșterea potențialului de randament al orezului prin ingineria unei fotosinteze eficiente de tip C4 în orez (Kajala et al. 2011). Pentru aceasta, un set de gene care reglează anatomia frunzelor și procesele biochimice trebuie să fie inserate în orez și exprimate într-un mod adecvat, ceea ce nu este posibil în prezent numai prin tehnici convenționale de ameliorare a plantelor. Prin urmare, ingineria genetică pentru îmbunătățirea căii fotosintetice a orezului ar oferi suficiente oportunități pentru a spori productivitatea reală a boabelor, precum și potențialul de randament. Ingineria genetică oferă un instrument de ameliorare eficient și precis, în care pot fi introduse doar genele de interes, chiar și de la specii înrudite la distanță.

În plantele C3, precum orezul, CO2 este asimilat într-un compus cu 3 atomi de carbon de către enzima fotosintetică ribouloză-1,5-bisfosfat-carboxilază oxigenază (Rubisco). După cum indică și numele, Rubisco catalizează, de asemenea, oxidarea ribozei-1, 5-bisfosfat (RuBP) într-un proces de risipă cunoscut sub numele de fotorespirație, care poate duce la o pierdere de până la 25% din carbonul fixat anterior (Sage 2004). La temperaturi de peste 30°C, care sunt tipice pentru zonele tropicale de cultivare a orezului din lume, rata de oxigenare crește substanțial și acest lucru reduce considerabil eficiența fotosintetică a plantelor C3 cu până la 40% (Ehleringer și Monson 1993). Astfel, fotosinteza orezului la tropice și în regiunile temperate calde devine ineficientă. Plantele C4, care dispun de un mecanism de concentrare a CO2 în frunzele lor, au niveluri foarte reduse de fotorespirație și, prin urmare, au evoluat pentru a prospera în mediile calde și aride și oferă informații valoroase pentru strategiile de îmbunătățire a culturilor. Orezul cu un mecanism de fotosinteză C4 ar avea o eficiență fotosintetică crescută, utilizând în același timp mai eficient resursele limitate, cum ar fi pământul, apa și îngrășămintele, în special azotul (Hibberd et al. 2008). Deoarece va funcționa bine la temperaturi ridicate, precum și pentru că va necesita mai puțină apă și azot, orezul C4 ar conferi beneficii pentru diferite tipuri de ecosisteme de orez, inclusiv pentru terenurile marginale.

Fosinteza de tip C4 este unul dintre cele trei tipuri de mecanisme biochimice adoptate de plante pentru a fixa CO2 atmosferic, celelalte fiind C3 și căile de metabolizare a acizilor de la Crassulacean (CAM). Fotosinteza de tip C4 a evoluat de peste 66 de ori în mod independent (Sage et al. 2012), cel puțin în 19 familii în timpul evoluției angiospermelor de la strămoșii C3 (Muhaidat et al. 2007) și presupune alternanțe ale structurilor celulare, ale biochimiei și, prin urmare, ale dezvoltării frunzelor. Această formă foarte specializată de fotosinteză a dezvoltat, în esență, un mecanism de concentrare a CO2 în jurul enzimei Rubisco, eliminând astfel funcția de oxigenază a Rubisco și reducând astfel risipa de energie datorată fotorespirației (Douce și Heldt 2000). Rubisco de la speciile C4 este mai eficientă decât cea de la speciile C3 în ceea ce privește carboxilarea (Kubien et al. 2008). Printre celelalte beneficii asociate sistemului C4 se numără o eficiență mai mare a utilizării apei, deoarece poate fi menținut un gradient de concentrație mai abrupt pentru difuzia CO2 prin intermediul stomatelor parțial închise, o eficiență mai mare a utilizării radiației, deoarece eficiența fotosintezei C4 nu se saturează la o intensitate luminoasă ridicată (Rizal et al. 2012) și o eficiență mai mare a utilizării azotului, deoarece va necesita mai puțin Rubisco și, prin urmare, mai puțin azot.

Plantele C4 sunt potențial mai productive la temperaturi mai ridicate la care se confruntă de obicei orezul. Pentru a profita de acest sistem fotosintetic mai eficient într-un moment în care populația și prețurile alimentelor sunt în creștere, există eforturi în vederea inserării în orez a mecanismului C4, cum ar fi cel întâlnit la porumb (Rizal et al. 2012). Această abordare nouă de modificare a sistemului de fotosinteză al orezului reprezintă o provocare și un efort pe termen lung, deoarece calea C4 este foarte complexă și mulți factori care controlează mecanismul sunt încă necunoscuți. Prin urmare, este nevoie de ingeniozitatea și expertiza oamenilor de știință implicați în diverse discipline, cum ar fi ingineria genetică, biochimia, bioinformatica, biologia moleculară, fotosinteza, biologia sistemelor, fiziologia, ameliorarea plantelor, metabolomica etc. Pentru același lucru, a fost conceptualizat și înființat consorțiul orezului C4, care a început activitatea practică de inginerie a orezului C4 începând cu 2009 (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Această analiză oferă o actualizare a cerințelor pentru dezvoltarea orezului C4 și a progreselor înregistrate în domeniul ingineriei genetice. Pe baza studiului evoluției C4 din speciile C3 și a modificărilor asociate, următoarele modificări sunt esențiale pentru a stabili o cale fotosintetică C4 funcțională în orez.

Creșterea numărului și a dimensiunii cloroplastelor din celulele tecii fasciculului de orez

În orez, mai mult de 90% din totalul cloroplastelor sunt localizate în celulele mezofile (MC) din frunză (Yoshimura et al. 2004); în timp ce, la plantele C4, atât MC, cât și celulele tecii fasciculului (BSC) posedă un număr egal de cloroplaste (figura 1A și B). Acest lucru se datorează faptului că, la plantele C3, întregul proces de fotosinteză are loc în MC, dar la plantele C4 procesul de fotosinteză este compartimentat în MC și BSC. MC-urile realizează prima fixare a CO2 în care se formează un compus cu 4 atomi de carbon numit oxaloacetat, care este transformat în acizi C4, cum ar fi malatul, care este transportat în BSC-uri, permițând astfel asimilarea eficientă a CO2 în carbohidrați prin ciclul Calvin în BSC-uri. Prin urmare, spre deosebire de plantele C3, BSC-urile din plantele C4 au funcții fotosintetice, cum ar fi decarboxilarea compusului C4 și procesul ciclului Calvin. Pentru a realiza aceste procese, BSC-urile din plantele C4 sunt mărite și au mai multe cloroplaste, ceea ce face ca BSC-urile să fie mai pronunțate și mai active din punct de vedere fotosintetic. La speciile C3, BSC-urile au rolul de a echilibra presiunea hidraulică, de a împiedica intrarea aerului din spațiile intercelulare în xilem, de a asigura un rezervor de apă pentru a tampona pierderile datorate transpirației, de a permite intrarea și dispersia în frunză a luminii de intensitate mai mare care lovește nervurile (Nikolopoulos et al. 2002). Funcțiile suplimentare ale BSC ale plantelor C3 includ transportul azotului, sulfului, carbohidraților și rolul în calea de semnalizare, care a fost analizat pe larg în (Leegood 2008). La speciile C4, BSCs și MCs cooperează într-o versiune în două etape a fotosintezei. Ca urmare, pentru a asigura un contact direct între BSC și MC, plantele C4 posedă un tip special de anatomie a frunzelor însoțit de proliferarea cloroplastelor în BSC. Pentru a introduce calea C4 în orez, sunt necesare mai multe cloroplaste fotosintetice în BSC-uri decât cele pe care le are acum orezul. Acest lucru ar putea fi realizat prin supraexprimarea elementelor genetice care sunt necesare pentru dezvoltarea cloroplastelor, cum ar fi genele Golden2-like (GLK), într-o manieră specifică celulei, utilizând promotori ai genelor C4, cum ar fi fosfoenol piruvat carboxilaza (PEPC) de la Zea mays pentru expresia specifică MC și promotorul fosfoenol piruvat carboxikinazei (PCK) de la Zoysia japonica pentru expresia specifică BSC în frunzele de orez (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Membrii familiei de gene Golden2-like (GLK) codifică factori de transcripție nucleară care au fost implicați în reglarea dezvoltării cloroplastelor la Arabidopsis, Zea mays și la mușchiul Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). La fiecare dintre aceste specii, genele GLK există sub forma unei perechi omoloage denumite GLK1 și GLK2 (Waters et al. 2009). La mușchi și Arabidopsis, genele GLK sunt redundante și echivalente din punct de vedere funcțional, în timp ce, la porumb și sorg, genele GLK acționează într-o manieră specifică tipului de celulă pentru a direcționa dezvoltarea cloroplastelor dimorfice (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). La porumb, transcripțiile Golden2 (G2) și omologul său ZmGLK1 se acumulează în principal în celulele BS și, respectiv, M, sugerând un rol specific pentru fiecare genă în reglarea diferențierii cloroplastelor dimorfe (Wang et al. 2013a).

Reduceți distanța dintre nervuri, crescând astfel densitatea nervurilor în frunze

La speciile C3, fotosinteza are loc în MC. Un număr mare de MC-uri între nervurile consecutive (figura 1A) împinge nervurile departe unele de altele, crescând astfel spațierea nervurilor sau reducând densitatea acestora. În frunzele de orez există mai puțin de 6 nervuri pe mm (figura 2A), în timp ce Setaria viridis și sorgul (ambele sunt specii tipice C4) au mai mult de 7 nervuri pe mm (figura 2B și C). Frunzele C4 au în medie 2 MC între nervuri (Figura 1B). Densitatea mai mare a venelor în frunzele plantelor C4 conduce la un raport aproape unu la unu între volumele țesuturilor M și BS. Anatomia internă a unei frunze C4 este adesea compusă dintr-un model repetitiv de venă-BS-M-M-M-BS-venă. BSC-urile înconjurate de MC-uri formează o structură asemănătoare unei coronițe; acest tip de anatomie a frunzelor a fost denumit „anatomia Kranz” de către botanistul german G. Haberlandt. BSC-urile C4 au citoplasmă densă și sunt pline cu un număr mare de cloroplaste (figura 1B). Pentru funcționarea eficientă a căii C4, este indispensabil un contact strâns între celulele M și BS, iar acestea sunt strâns interconectate între ele cu un număr mare de plasmodesmate Dengler și (Nelson 1999). Anatomia Kranz se regăsește cu puține variații în aproape toate neamurile de monocotiledonate și dicotiledonate care utilizează modul cu două celule al căii fotosintetice C4. Studiile privind anatomia și morfologia frunzelor au pus în evidență mai multe gene responsabile de creșterea, dezvoltarea sau deformarea celulelor din frunze. O genă ACAULIS1 a fost responsabilă de alungirea celulelor frunzelor (Tsukaya et al. 1993). Mutația genei CURLEY LEAF (CLF) a produs frunze curbate la Arabidopsis (Kim et al. 1998). Creșterea terminației venelor libere, a modelului de venație deschisă și a structurii rotunjite a frunzelor au fost cauzate de rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). Mutația în gena Scarecrow la porumb a arătat o creștere a numărului de BSC, o diferențiere neobișnuită a cloroplastului BS, o scădere a nervurilor minore și o modificare a densității venelor (Slewinski et al. 2012). Aceste studii legate de configurația anormală a venelor cauzată de mutația anumitor gene oferă indicii cu privire la modul în care este reglată anatomia Kranz și sugerează implicarea mai multor căi în dezvoltarea modelului Kranz. S-a stabilit că rețeaua de reglementare SCARECROW/SHORTROOT este una dintre componentele importante necesare pentru modelarea anatomiei Kranz, deoarece frunzele plantelor C3 cu mutația genei Scarecrow erau normale, în timp ce la plantele C4, mutația în aceeași genă a afectat anatomia Kranz (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Recent, s-a demonstrat că introducerea cromozomilor de porumb în ovăz ar putea crește dimensiunea BSC și reduce spațierea nervurilor în frunzele de ovăz C3, demonstrând că anatomia frunzei C3 poate fi modificată (Tolley et al. 2012). Mai mult decât atât, s-au depus eforturi mari pentru a depista mutanți de sorg (C4) cu spațiere crescută a venelor și mutanți de orez (C3) cu spațiere redusă a venelor, astfel încât să poată fi identificate genele care controlează trăsătura de spațiere a venelor (Rizal et al. 2012).

Activitatea ciclului Calvin ar trebui să fie semnificativ redusă în MC și mult îmbunătățită în BSC al orezului

Posinteza C4 este caracterizată de un mecanism biochimic de pompare a CO2 care ridică concentrația de CO2 la locul unde se află Rubisco. Un nivel ridicat de CO2 în jurul Rubisco reduce rata de fotorespirație și crește asimilarea netă de CO2, ceea ce duce la o fotosinteză foarte eficientă Weber și von (Caemmerer 2010). Pentru a realiza acest lucru, asimilarea CO2 în C4 este distribuită pe două tipuri de celule, MCs și BSCs (figura 3). Prin urmare, fixarea carbonului în C4 depinde de expresia și localizarea genelor specifice fiecărei celule. Celulele BS și M vecine, active din punct de vedere fotosintetic, interacționează pentru a elimina fixarea O2 catalizată de Rubisco. La plantele C4 de tip bicelular, CO2 este la început fixat în acidul C4 numit oxaloacetat în MC-uri de către o carboxilază insensibilă la O2 numită fosfoenol piruvat carboxilază (PEPC, EC 4.1.1.1.31). Oxaloacetatul este apoi transformat în malat sau aspartat și este transportat în BSC, unde este decarboxilat, iar CO2 este eliberat. Acest CO2 este refixat de Rubisco și toate activitățile ulterioare ale ciclului Calvin au loc în cloroplastul BSC-urilor (Nelson și Langdale 1989). Prin urmare, pentru ca orezul C4 să funcționeze, activitatea Rubisco trebuie să fie mult redusă în MC și crescută în BSC, ceea ce limitează ciclul Calvin la BSC din orez, ca într-un sistem C4. Pe de altă parte, anumite gene care codifică enzimele C4, cum ar fi β anhidraza carbonică (CA) și PEPC, trebuie să fie supraexprimate în citosolul MC de orez pentru a facilita fixarea primară a CO2, astfel încât CO2 să poată fi concentrat și furnizat Rubisco în BSC. Ciclul C4 implică, de asemenea, un transport extensiv de metaboliți prin membrana de înveliș a cloroplastului și plasmalema din MC și BSC (figura 3). Ca atare, pe lângă enzimele de bază C4, și anume CA, PEPC, piruvat ortofosfat (Pi) dikinaza (PPDK, EC 2.7.9.1), malat dehidrogenază dependentă de NADP (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) și enzima malică dependentă de NADP (NADP-ME, EC 1.1.1.1.82) și enzima malică dependentă de NADP (NADP-ME, EC 1.1.1.40), calea C4 necesită, de asemenea, inserția în orez a transportatorilor de metaboliți pentru oxaloacetat, malat, trioză-fosfat și piruvat pentru a asigura o capacitate de transport sporită pentru intermediarii ciclului C4, astfel încât ciclul Calvin să poată funcționa eficient în BSC (Weber și von Caemmerer 2010).

Fotorespirația în celulele mezofile trebuie să fie foarte redusă

În plantele C3, fixarea carbonului și ciclul Calvin au loc în MC-uri. În timpul fixării carbonului, ribouloza-1,5 bisfosfat (RuBP) – un compus cu cinci atomi de carbon, catalizat de o enzimă ribouloza-1,5-bisfosfat carboxilază oxigenază (Rubisco, EC.4.1.1.1.39) reacționează cu CO2 pentru a forma două molecule de compus cu 3 atomi de carbon numit 3-fosfoglicerat (3-PGA). În cadrul ciclului Calvin, cele două molecule de PGA formează o moleculă de zahăr bogată în energie (triosa fosfat) și regenerează RuBP pentru următorul ciclu. La concentrațiile actuale de CO2 din atmosferă (cca. 400 ppm), Rubisco catalizează, de asemenea, o reacție între RuBP și O2, rezultând câte o moleculă de 2-fosfoglicolat și 3-PGA (Peterhansel și Maurino 2011). 2-fosfoglicolatul trebuie să fie transformat înapoi în 3-PGA prin procesul numit fotorespirație, care implică o serie de reacții biochimice. În timpul acestui proces are loc o pierdere de carbon și azot fixat anterior și trebuie, de asemenea, utilizată energie suplimentară (Sharpe și Offermann 2013).

C4 plantele au dezvoltat mecanisme pentru a restricționa localizarea și activitățile Rubisco în BSC-uri. MC-urile împiedică spațial contactul dintre Rubisco în BSC-uri și O2 în spațiile intercelulare, împiedicând astfel pierderea de energie prin fotorespirație. Eliminarea fotorespirației de către plantele C4 este evidențiată de punctul lor foarte scăzut de compensare a CO2, care este aproape zero, și de eficiența de carboxilare (CE) constant ridicată, fără a răspunde la modificările concentrațiilor de O2 (figura 4). În schimb, la plantele C3, odată cu modificarea concentrației de O2 de la 21% la 2%, punctul de compensare a scăzut semnificativ de la 55 la 30 ppm (tabelul 1). În figura 4, CE a fost calculat în conformitate cu (Li et al. 2009), care a arătat că CE la sorg nu s-a modificat semnificativ odată cu modificarea nivelului de O2, dar la orez a existat o îmbunătățire foarte semnificativă a CE atunci când nivelul de O2 a fost redus de la 21 la 2% (figura 4 și tabelul 1). Creșterea CE la sorg a fost de doar 6,1% la sorg, în timp ce la orez a fost de 41,5% la scăderea concentrației de O2 intercelular la 2% (tabelul 1). Aceste date arată că există un mare potențial de creștere a capacității fotosintetice a orezului prin diminuarea fotorespirației, ceea ce, la rândul său, ar duce la o creștere substanțială a randamentului. O modalitate de a reduce fotorespirația în MC este reducerea proteinei glicină decarboxilază (GDC) în MC și limitarea acumulării acesteia în BSC, astfel încât decarboxilarea glicinei să aibă loc exclusiv în BSC, generând astfel o concentrație mai mare de CO2 în BSC, similară cu cea din intermediarii C3-C4 (Monson și Rawsthorne 2000). Consorțiul de orez C4 testează această abordare prin utilizarea microARN artificial conceput împotriva subunității GDC-H a orezului, care este condus de promotorul ZmPEPC (Kajala et al. 2011). Un astfel de mecanism biochimic necesită o specializare celulară a BSC-urilor, care include o creștere a numărului de cloroplaste și mitocondrii, îmbogățind conținutul de organite al BSC-urilor din orez pentru a ajuta la recapturarea CO2 eliberat prin decarboxilarea glicinei de către GDC (Ueno 2011). O altă abordare care a avut succes în captarea CO2 eliberat prin fotorespirație la locul de fotosinteză este transferul căii catabolice a glicolatului din Escherichia coli către cloroplastele de Arabidopsis thaliana, în care glicolatul din cloroplaste a fost transformat direct în glicerat (Kebeish et al. 2007). Această strategie, care a redus fotorespirația și a îmbunătățit fotosinteza la Arabidopsis, a implicat o transformare nucleară în trepte cu cinci gene bacteriene orientate spre cloroplaste care codifică glicolat dehidrogenază, glioxilat carboligază și tartronic semialdehidă reductază, ar putea fi aplicată la alte plante C3, cum ar fi orezul; cu toate acestea, este posibil ca utilizarea genelor bacteriene să nu fie preferată în ingineria orezului C4.

Tehnologizarea căii C4 în orez

S-a crezut că sistemul C4 unicelular ar putea fi mai rapid de instalat în plantele C3. Există încercări de a inginera sistemul de fotosinteză C4 unicelular și în orez (Miyao et al. 2011). Pentru a introduce o cale unicelulară de tip C4 în care MC este făcută să capteze și să elibereze CO2 în modul în care are loc în Hydrilla verticillata (L.f) Royle, patru enzime (PEPC, PPDK, NADP-MDH și NADP-ME) implicate în această cale au fost supraproduse în frunzele de orez transgenic (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Câteva dintre problemele majore întâlnite care trebuie abordate pentru a realiza o cale monocelulară asemănătoare C4 la orez sunt: mecanismul de facilitare a activității de transport a PEP prin învelișul cloroplastic, importul de OAA în cloroplaste și direcția reacției NADP-ME, implicarea NADP-MDH, prezența PEPC endogene în interiorul cloroplastului MC al orezului și creșterea suplimentară a activității NADP-MDH au fost raportate ca fiind necesare (Miyao et al. 2011). Speciile C4 terestre cu o singură celulă, cum ar fi Bienertia cycloptera, B. sinuspersici și Suaeda aralocaspica, aparținând familiei Chenopodiaceae, necesită, de asemenea, o compartimentare spațială a asimilării și decarboxilării carbonului (Chuong et al. 2006). Aceste specii au cloroplaste dimorfice în aceste compartimente. Încercările anterioare au produs un ciclu zadarnic, care s-a datorat faptului că nu s-a produs nicio schimbare în anatomie, nu existau transportatori adecvați, iar genele de porumb transformate în orez nu erau exprimate în mod corespunzător în mod specific pentru fiecare celulă și nu erau reglementate ca în cazul porumbului, ci erau reglementate ca izoformele C3 endogene ale orezului (Miyao et al. 2011).

Pentru a inginera calea fotosintetică de la C3 la C4 în decurs de două decenii, ceea ce a durat milioane de ani în natură, consorțiul C4 rice a început descoperirea simultană a genelor și ingineria simultană a genelor deja cunoscute în orez, cu scopul de a forma orez C4 cu anatomie de tip Kranz. Genele C4, cum ar fi CA, PEPC, PPDK, NADP-ME și NADP-MDH sunt clonate din porumb și transformate în orez. De asemenea, transportatorii care au fost supraexprimați în căile metabolice C4, cum ar fi transportatorul de 2-oxoglutarat/malat (OMT1), transportatorul de dicarboxilat1 (DiT1), transportatorul de dicarboxilat2 (DiT2), transportatorul de PEP/fosfat (PPT1), proteina învelișului mezofilic (MEP) și translocatorul de fosfat de trioză-fosfat (TPT), care au fost recent identificați prin proteomică în celulele BS și MS din porumb (Friso et al. 2010) sunt transformate în orez (figura 3). Membrii consorțiului C4 rice sunt, de asemenea, implicați în descoperirea unor gene noi legate de anatomia Kranz (Wang et al. 2013b). Odată testate, genele candidate promițătoare care controlează anatomia Kranz vor fi introduse, de asemenea, în plantele de orez care au fost modificate cu genele căilor biochimice C4.

.