3.1.2 Azide
Azidele sunt considerate ca fiind una dintre cele mai potrivite grupe pentru reacții bioortogonale și pentru chimia click. Spre deosebire de cetonă și aldehidă, nu există aproape deloc azide care să apară în sistemele biologice. Azidele posedă o energie intrinsecă ridicată, dar nu au un partener natural de reacție (King și Wagner, 2014), au dimensiuni mici și sarcină globală neutră și, în cele din urmă, sunt stabile din punct de vedere cinetic în condiții fiziologice.
Legatura Staudinger (Staudinger și Hauser, 1921) pare a fi un bun candidat pentru reacțiile de bioconjugare care utilizează azide. În această reacție, azidele reacționează cu reactivi de trifenilfosfină care conțin o capcană electrofilă pentru a produce un intermediar aza-ilid care reacționează cu gruparea carbonil ester electrofilă formând un inel cu cinci membri care este supus hidrolizei pentru a genera o legătură amidă finală stabilă (Fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013; Staudinger și Hauser, 1921). O nouă variantă a acestei reacții a fost descrisă la scurt timp după aceea (King și Wagner, 2014; Saxon și Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000), denumită „legare Staudinger fără urmă”, în care produsul final cu legătură amidică este eliberat de fracțiunea oxid de fosfină.
Figura 5.6. Exemple de reacții de bioconjugare cu azide. (A) ligatura Staudinger; (B) cicloadiția azidă-alchină catalizată cu cupru; (C) cicloadiția azidă-alchină promovată de tulpină; (D) cicloadiția cu oxanorbornadiene. UAA, aminoacizi nenaturali.
Legatura Staudinger a fost utilizată într-o varietate de aplicații. De exemplu, Raines și colab. au aplicat această reacție ca alternativă fără cisteină la NCL pentru legarea peptidelor (Nilsson și colab., 2001) și în combinație cu NCL în asamblarea ARNazei A artificiale (Nilsson și colab., 2005). În plus, a fost utilizată și în alte aplicații, cum ar fi imobilizarea proteinelor pe suport solid pentru imagistică in vitro și in vivo (Saxon și Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), marcarea biomoleculelor in vitro și in vivo (Saxon și Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), îmbogățirea proteinelor (Vocadlo et al., 2003) și detectarea (Charron et al., 2009), precum și (Lemieux et al., 2003) modificarea proteinelor.
Cu toate acestea, ligatura Staudinger prezintă unele dezavantaje. Și anume, cinetica sa lentă (constanta de viteză de ordinul al doilea în intervalul scăzut de 10-3 M-1s-1) (Lin et al., 2005), labilitatea de oxidare a compușilor de fosfină (necesitatea de a utiliza concentrații relativ mari ale reactivului de fosfină) și potențialul de reactivitate încrucișată a fosfinelor cu disulfurile (Lang și Chin, 2014; King și Wagner, 2014).
Azidele pot reacționa cu alchinele într-o cicloadiție azidă-alchină catalizată cu Cu(I) (CuAAC) sau o cicloadiție 1,3-dipolară (Fig. 5.6B), unul dintre cele mai standard exemple de reacții de chimie clic (Rostovtsev et al., 2002; Tornøe et al., 2002). Această reacție prezintă un interes ridicat în științele biologice datorită selectivității sale bune, randamentului ridicat și condițiilor blânde de reacție (temperatura camerei în diverși solvenți). În plus, atât azidele, cât și alchinele sunt introduse în proteine fără a afecta structura și funcția proteică (Steen Redeker et al., 2013). Azida și alchina pot forma foarte rapid o legătură stabilă de 1,2,3-triazol în condiții fiziologice, în prezența Cu(I). Mecanismul propus de Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) descrie mai întâi introducerea alchinei terminale într-o acetilidă de cupru și un atac ulterior al azidei (King și Wagner, 2014). Recent, acest mecanism a fost rafinat în continuare și a fost propus un intermediar dicopru (Worrell et al., 2013). Dezavantajele majore ale acestei reacții sunt reacțiile secundare dependente de Cu(I) și citotoxicitatea Cu(I) (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), care au limitat aplicarea sa în principal pentru marcarea în spațiul extracelular (King și Wagner, 2014). CuAAC a fost utilizat pe scară largă în numeroase studii biologice diferite, de exemplu, pentru marcarea fosfolipidelor în vederea obținerii de imagini ale acestora in vivo (Jao et al., 2009) și in vitro (Neef și Schultz, 2009), pentru remodelarea suprafeței virusurilor (Steinmetz et al, 2009), pentru modificarea/etichetarea proteinelor in vitro și in vivo (Link și Tirrell, 2003; Ngo și Tirrell, 2011; Liu și Schultz, 2010; Deiters și colab., 2003), pentru etichetarea acizilor nucleici (Weisbrod și Marx, 2008) și pentru profilarea probelor pe bază de afinitate (Speers și colab., 2003).
S-au dezvoltat diferite abordări pentru a depăși citotoxicitatea cuprului. Și anume, utilizarea liganzilor solubili în apă pentru coordonarea Cu(I), utilizarea azidelor organice care chelatizează cuprul și introducerea tensiunii inelare în fracțiunea alchină. În primul caz, liganzii solubili în apă coordonează Cu(I) pentru a forma un catalizator de cupru activat capabil să promoveze CuAAC la concentrații micromolare scăzute de metal, reducând în același timp potențiala toxicitate a Cu(I) (Besanceney-Webler și colab., 2011; Del Amo și Wang, 2010; Hong și colab., 2009; Kennedy și colab., 2011). În cel de-al doilea caz, concentrația efectivă de Cu(I) este crescută la locul de reacție prin utilizarea liganzilor azidă care conțin o fracțiune internă de chelare a cuprului (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). Ultima strategie implică utilizarea de alchine, care au fost activate pentru a reacționa cu o cinetică îmbunătățită în absența catalizatorului. În acest sens, utilizarea fracțiunilor ciclooctyne crește reactivitatea ca urmare a eliberării tensiunii inelare (Steen Redeker și colab., 2013; Baskin și colab., 2007; Plass și colab., 2011). Cicloadiția azidă-alchină promovată de tulpină (SPAAC) (Fig. 5.6C) a devenit un instrument puternic nu numai pentru marcarea proteinelor și a anticorpilor, ci și pentru alte aplicații, cum ar fi analiza Western Blot fără anticorpi (Boutureira et al., 2015), deoarece nu sunt necesari reactivi suplimentari sau metale toxice care pot deteriora biomoleculele. De exemplu, Bertozzi și colab. au demonstrat aplicabilitatea sa la modificarea proteinelor purificate (Baskin și colab., 2007). În experimentele ulterioare, reacția a fost aplicată cu succes in vitro la celulele fibroblaste (Baskin et al., 2007). În plus, SPAAC a fost utilizat pentru a obține imagini ale tumorilor la șoareci vii cu ajutorul nanoparticulelor (Koo et al., 2012) și al 18F PET, unde fluorul a fost atașat atât la azidă, cât și la cicloalchină (Jeon et al., 2012). Alte domenii de aplicare au fost găsite în modificarea virusurilor și marcarea ADN-ului (Qiu et al., 2013). Cu toate acestea, sinteza complexă a ciclochinelor și faptul că volumul și hidrofobicitatea crescută a acestora pot afecta structura și stabilitatea proteinelor (Kim et al., 2013), iar activarea lor crescută poate favoriza reacții secundare cu tiolii naturali pot fi considerate dezavantaje.
Sulfonil azidele cu deficit de electroni pot, de asemenea, să reacționeze cu alchene activate (oxanorbornadiene sau norbornene) într-o cicloadiție fără metale (Fig. 5.6D), similară cu SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Cu toate acestea, produsul cicloadițiilor azidă-alchene este o triazolină relativ instabilă, spre deosebire de triazolii aromatici formați în cicloadiția clasică de clic. O oxanorbornadienă care este în același timp tensionată și cu deficit de electroni a fost utilizată ca dipolarofil într-o reacție cu azide (van Berkel et al., 2008). În acest caz, dubla legătură tensionată din oxanorbornadiene reacționează cu azidele pentru a forma o triazolină intermediară care suferă spontan o reacție Diels-Alder retro, cu eliberare de furan, conducând la 1,2,3- sau 1,4,5-triazoli stabili. Această reacție a fost utilizată pentru a bioconjuga în mod selectiv o proteină funcționalizată cu oxanorbornadiene și o peptidă ciclică modificată cu azidă în tampoane apoase. Deși oxanorbornadienele sunt mai ușor de sintetizat decât omologii lor ciclooctilieni, această reacție de cicloadiție este destul de lentă și nu este în întregime chemoelectivă în ceea ce privește alte grupări funcționale care se găsesc în proteine, ceea ce ar fi putut limita utilizarea sa pe scară largă (Lang și Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).
.