Free Press

Proteina majoră a capsidei P74-26 utilizează caracteristici arhitecturale unice – bazele, inelele și flapsurile – pentru a spori stabilitatea capsidei. Observăm interacțiuni hidrofobe îmbunătățite la interfețele subunitate-subunitate din cadrul capsidei. Se estimează că interacțiunile hidrofobe sunt de >2 ori mai mari pentru P74-26 decât pentru alți omologi mezofilici (tabelele suplimentare 3 și 4). Această observație poate explica parțial termostabilitatea sporită a capsidei P74-26, deoarece efectul hidrofob își sporește puterea la temperaturi ridicate32. În schimb, nu observăm nicio modificare semnificativă în ceea ce privește numărul de legături de hidrogen sau de punți de sare (tabelele suplimentare 3 și 4), alte interacțiuni care au fost văzute ca fiind cele care conferă termostabilitate pentru unele proteine globulare33,34,35,36.

Nu am fost deosebit de surprinși să găsim interacțiuni hidrofobe crescute în capsida P74-26. Numeroase studii ale proteinelor globulare termofile arată că forțele hidrofobe crescute sunt un factor major care contribuie la stabilitatea termică33,37,38,39,40. Cu toate acestea, există două lucruri care fac din capsida P74-26 un sistem model unic: (1) presiunea internă ridicată de la ADN-ul strâns împachetat induce stres mecanic în capsidă7,8,27 și (2) este o structură de autoasamblare în care arhitectura și topologia inter-subunități joacă un rol important în stabilitatea generală. Putem deriva aceste principii prin compararea structurii P74-26 cu cele a numeroșilor omologi mezofilici.

Am constatat că capsida P74-26 este stabilizată de mai multe bucle și extensii care formează legături topologice între subunități. Lațul unic al buclei E se atașează la bucla G și la domeniul P al unei MCP vecine, care acționează ca un cârlig de legătură pentru legarea topologică a lațului. Mai mult, brațele N și C, împreună cu brațul Dec, înconjoară complet laturile β din bucla E, un alt element arhitectural unic pentru P74-26 (Fig. 5e). Astfel, bucla E este inelată spre bază și legată în lasso spre vârf.

Un al doilea lasso este format de brațul N, care formează interacțiuni atât intra-capsomer cât și inter-capsomer. Brațul N se leagă de bucla E a unui MCP vecin în cadrul unui capsomer prin intermediul șirului brațului superior, al helixului antebrațului și al regiunii mâinii (Fig. 5a, c). Mai mult decât atât, cotul, antebrațul și mâna stabilizează interacțiunile capsomer-capsomer prin legarea cu DecP74-26 și o subunitate MCP care se află pe axele dublu/ cvasi-dublu (Fig. 6a, b). Deși brațul N nu este, din punct de vedere tehnic, o buclă închisă, P74-26 închide efectiv bucla folosind bucla S unică pentru a fixa poziția regiunilor antebrațului și a mâinii (Fig. 6c). Nu găsim o arhitectură lasso similară a brațului N în Caudovirusurile mezofile31,41,42,43,44,45,46, ceea ce sugerează că această arhitectură este importantă pentru creșterea stabilității capsidei.

Deși lasso nu se găsește în alte Caudovirusuri, herpesvirusurile înrudite la distanță conțin o arhitectură lasso analogă în brațul N al pliului HK9747,48,49. La fel ca brațul N al P74-26, lasso-urile din brațul N al herpesvirusurilor nu sunt adevărate bucle închise. În ciuda acestei similitudini aparente, lasso-urile din herpesvirusuri funcționează diferit. Ele stabilizează exclusiv interacțiunile inter-capsomeri, în timp ce lasoul brațului N al P74-26 stabilizează atât interacțiunile intra-capsomeri cât și cele inter-capsomeri. Mai mult, pentonii capsidelor herpesvirusurilor nu prezintă interacțiuni lasso, iar interacțiunile sunt variabile în cadrul subunităților hexonice, în timp ce P74-26 are interacțiuni lasso aproape identice în cadrul pentonilor și hexonilor. Aceste observații indică faptul că arhitectura lasso a evoluat probabil independent și evidențiază flexibilitatea mecanismelor de stabilizare topologică. Formulăm ipoteza că arhitectura brațului extensibil facilitează evoluția unor interacțiuni mai puternice în cadrul sistemelor de autoasamblare, cum ar fi capsidele. Aceste bucle cu capăt deschis pot fi ușor îmbunătățite prin extinderea în serie a unui singur reziduu. Poate că această ușurință de evoluție este motivul pentru care lasourile cu brațe extinse se găsesc atât în P74-26, cât și în herpesvirusuri. Aceste lasso-uri extinse sunt similare cu extensiile N- și C-terminale care mediază asamblarea în alte virusuri (de exemplu, extensiile C-terminale din proteinele de acoperire a capsidei SV4050). Anticipăm că aceste tipuri de lasso-uri extinse pot fi utile pentru proiectarea unor capside mai stabile și a altor particule care se autoasamblează.

Un alt avantaj al arhitecturii lasso este că poate adopta o conformație mai puțin extinsă. P74-26 MCP are două lasso-uri la fiecare capăt al pliului HK97, ambele fiind probabil prezente în procapsida mult mai mică. Prin utilizarea acestor structuri lasso, P74-26 poate păstra o stabilitate ridicată, oferind în același timp flexibilitate conformațională pentru a se extinde în timpul maturării. Am emis ipoteza că lasso-urile sunt mai puțin extinse în procapsidă; în momentul expansiunii capsidei, lasso-urile ating extensia maximă, unde se blochează la locul lor. Extinderea completă observată în capsida matură ar asigura integritatea tensională, așa cum discutăm mai jos.

P74-26 utilizează lambouri întrețesute pentru a stabiliza topologic contactele dintre capsomeri. Bucla T stabilizează interacțiunile intercapsomeriale prin inserția într-o canelură de pe domeniul P al unei subunități MCP dintr-un capsomer vecin. Aceste interacțiuni cu buclă în T se regăsesc în jurul axelor triplu/triplu cvasi-triplu de-a lungul feței interioare a capsidei (Fig. 7b; Fig. Suplimentară 7b). În mod similar, interacțiunile duble/cuasi duble între capsomeri sunt stabilizate pe fața exterioară a capsidei prin dispunerea intercalată a brațelor N (Fig. 7c; Fig. suplimentară 7a). Aceste structuri suprapuse se aseamănă cu dispunerea intercalată a clapetelor în partea superioară a unei cutii în mișcare. În acest mod, fețele exterioară și interioară ale capsidei sunt stabilizate de două interacțiuni separate ale clapetelor întrepătrunse. Propunem că aranjamentele de tip cutie mobilă observate pe axele de simetrie și cvasi-simetrie întăresc foarte mult capsida împotriva presiunii interne, deoarece acestea sunt dificil de perturbat din punct de vedere topologic. Cu toate acestea, se presupune că aceste aranjamente sunt, de asemenea, dificile de asamblat, ceea ce ridică întrebarea importantă cu privire la modul în care capsida P74-26 se asamblează cu o arhitectură intercalată.

Proteina de decorare P74-26 adoptă, de asemenea, un aranjament structural unic, contribuind substanțial la termostabilitatea capsidei. Proteinele de decorare cresc stabilitatea capsidei28,29,51, deși au fost postulate roluri suplimentare52. Axele triplu/triplu cvasi-triplu sunt stabilizate de trimerul DecP74-26. În comparație cu Caudovirusurile mezofile, trimerul DecP74-26 interacționează cu mai multe subunități pe o suprafață de interacțiune mult mai mare (Fig. 8a). Suprafața totală de interacțiune pentru fiecare subunitate DecP74-26 este destul de remarcabilă: ~4100;Å2 pentru o proteină cu 146 de resturi. Studiul nostru anterior a arătat că DecP74-26 este substanțial mai stabilă decât omologii săi mezofilici, iar această stabilizare se realizează în primul rând prin formarea unui trimer extraordinar de strâns23. Cu toate acestea, interacțiunile de trimerizare reprezintă doar o mică parte din suprafața totală de interacțiune a DecP74-26 (~18% din suprafața totală de interacțiune pentru fiecare subunitate DecP74-26). Acest lucru sugerează că interacțiunea DecP74-26 cu capsida contribuie la o cantitate substanțială de stabilitate.

Interacțiunile dintre trimerii DecP74-26 formează o cușcă care ține capsida împreună (Fig. 8b). Acest aranjament este unic pentru P74-26. De exemplu, fagii lambda și TW1 utilizează un pliu foarte asemănător al proteinei de decorare23, dar interacțiunea brațului Dec al acestora cu alte proteine de capsidă este mult mai limitată29,44. Mai mult, proteina de decorare nelegată a fagului L nu se conectează cu trimerii vecini și, de fapt, lipsește la axele cvasi-trei pliuri52. Fagul T4 este decorat cu proteina Soc care interacționează cu subunitățile Soc vecine la axele triplă și cvasi-triplă; cu toate acestea, Soc este prezentă într-o ocupare relativ scăzută (~50%), astfel încât colivia este incompletă41. Deoarece proteinele de decorare sunt, de obicei, absente în procapsidă29, ne așteptăm ca cușca DecP74-26 să se asambleze în mod cooperativ la extinderea capsidei pentru a stabiliza capsida. Experimentele viitoare vor interoga rolul cooperativității în asamblare și stabilitate.

Îmbunătățirile arhitecturale din P74-26 MCP și Dec asigură stabilizarea împotriva presiunii interne ridicate. Cum acționează forțele din presiunea internă asupra capsidei și cum rezistă arhitectura capsidei la aceste tensiuni? Dacă presupunem că presiunea exercitată de ADN-ul încapsulat este distribuită uniform în jurul capsidei izometrice, atunci toate punctele de pe capsidă se confruntă cu un vector de forță care este perpendicular pe suprafața capsidei. Prin analogie, capsida este supusă unor forțe care sunt similare cu cele ale unui balon. Astfel, presiunea internă provoacă tensiuni laterale asupra interacțiunilor capsidei. În timp ce presiunea internă ridicată pe care o prezintă fagul pune la încercare stabilitatea capsidei, aceasta poate permite mecanisme de stabilitate care se bazează pe tensegrity. Este posibil ca presiunea internă să poată fi exploatată pentru a produce o particulă stabilizată prin stresul asupra subunităților individuale. În sprijinul acestei afirmații, capsidele picornavirusurilor, care se confruntă cu o presiune internă considerabil mai mică, pot fi stabilizate prin modificări minore ale capsidei53.

Arhitectura capsidei P74-26 este construită pentru a rezista la stresul lateral prin integritate tensională. Integritatea tensională, sau tensegrity, este un mecanism generalizat pentru stabilitatea arhitecturală care implică regiuni structurate ținute împreună de o rețea de elemente flexibile care sunt supuse unei tensiuni continue54. În capsida P74-26, domeniile A și P sunt regiunile structurate, iar lassoanele și brațele extinse sunt elementele flexibile care transmit tensiunea. De exemplu, lasosul cu bucla E va deveni tensionat împotriva stâlpului de agățare format de bucla G și domeniul P al vecinului. De asemenea, brațul N formează un lasou al cărui capăt este ținut pe loc de bucla S care se blochează în canelura dintre antebraț și mână (Fig. 6c). Astfel, prezicem că bucla S va prezenta caracteristicile unei legături de prindere, o legătură necovalentă care devine mai puternică sub tensiune55. Mai mult, capsida P74-26 conține mai multe clapete care se întrepătrund unele cu altele. Aceste interacțiuni ar rezista din punct de vedere topologic la tensiunile laterale și longitudinale ale presiunii interne. În ansamblul lor, aceste elemente de lasso și clapetă folosesc tensiunea pentru a rezista la eșecul structural al capsidei. Mecanismul de tensegritate observat aici este pur și simplu un exemplu mai elaborat de tensegritate a capsidei sugerat de Caspar cu mulți ani în urmă56.

Interacțiunile lasso, clapeta și brațul sunt poziționate astfel încât presiunea internă distribuie tensiunea pe mai multe legături. De exemplu, foaia β din bucla E suferă forțe de-a lungul axei foii. Astfel, toate legăturile care țin laolaltă foaia sunt supuse unor tensiuni, mai degrabă decât în cazul geometriei ortogonale în care tensiunea se exercită doar asupra legăturilor de la capătul foii. Ruperea capsidei ar necesita ruperea simultană a mai multor legături (o geometrie de forfecare), mai degrabă decât o geometrie de desfacere în care legăturile se rup una câte una57. Studiile pionierești cu o singură moleculă au arătat că o geometrie de forfecare necesită forțe mult mai mari pentru a se rupe decât atunci când forțele acționează într-o geometrie de desfacere58,59,60. Astfel, capsida P74-26 este construită astfel încât forțele laterale să acționeze într-o geometrie de forfecare, rezultând o tensegritate ridicată.

În plus față de arhitectura stabilizatoare unică a capsidei, P74-26 adoptă, de asemenea, un mecanism necanonic de modificare a capacității capsidei. Capsida lui P74-26 este mai mare decât la majoritatea caudovirusurilor, ceea ce se corelează cu genomul său anormal de mare. Majoritatea caudovirusurilor T = 7 au dimensiuni ale genomului între 30 și 50 kb (tabelul suplimentar 2), în timp ce genomul fagului P74-26 este aproape de două ori mai lung, cu 83 kb24. Pe baza dimensiunii genomului, am prezis că capsida ar fi T = 12 (dimensiunea medie a genomului ~80 kb61), deși T = 9 sau T = 13 ar fi fost posibile (dimensiunea medie a genomului ~70 sau ~120 kb, respectiv). Capsida P74-26 atinge această dimensiune mai mare prin creșterea semnificativă a dimensiunii capsomerului, mai degrabă decât prin modificarea complexității icosaedrice. Capsomerul este mai mare deoarece MCP P74-26 acoperă o suprafață mai mare decât în mod normal, în ciuda unei lungimi tipice pentru MCP. În consecință, capsomerul este ușor mai subțire decât în mod normal (Fig. 4b). Astfel, numărul de reziduuri din MCP nu prezice suprafața totală acoperită, iar dimensiunea genomului nu prezice numărul de triangulații.

Recent, Bayfield et al.62 au determinat structura unui fag termofilic T = 7 strâns înrudit, care utilizează în mod similar capsomeri măriți pentru a crește capacitatea capsidului. Din cunoștințele noastre, acesta este un mecanism necanonic pentru creșterea capacității capsidului. Există două mecanisme clasice de mărire a unui capsid: (1) creșterea numărului de triangulații și (2) conversia unui cap izometric în cap prolat. În primul caz, hexonii sunt adăugați pe toate fețele capsidei, în timp ce în al doilea caz, hexonii sunt adăugați pe zece dintre fețele icosaedrice, astfel încât capsida este alungită într-o singură dimensiune (Fig. 9). În ambele cazuri, capsomerii rămân de aceeași dimensiune. Aici, am identificat un al treilea mecanism de evoluție a unui capsid mai mare: creșterea dimensiunii capsomerului.

Aceste trei mecanisme au bariere evolutive foarte diferite. Cele două mecanisme clasice pot fi implementate prin mutații simple și au fost observate de numeroase ori. La mulți viruși, mutații punctuale simple modifică numărul de triangulație5,63,64. Mai mult, numărul de triangulație al unor capside poate fi modificat fără a schimba secvența MCP3,65,66. De asemenea, mutațiile punctiforme simple la fagul T4 transformă capsida din prolatată în izometrică sau generează capete gigantice în care axa lungă a capului prolatat este alungită4,67. Prin urmare, barierele evolutive pentru modificarea volumului capsidei prin cele două mecanisme clasice par a fi destul de scăzute. În schimb, strategia de mărire a capsomerului identificată aici necesită modificări multiple și extinse ale secvențelor proteinelor capsidei. Capsida mai mare a P74-26 necesită modificări mari ale celor opt modificări separate ale structurii MCP, precum și ale brațului Dec (Fig. 3a, b și 4c, d). Acest lucru duce la întrebarea: de ce a utilizat fagul P74-26 această strategie evolutivă aparent mai dificilă decât strategiile clasice, mai ușoare? Ce constrângeri au împiedicat evoluția unui capsid mai mare prin intermediul căilor clasice?

Prima noastră ipoteză este că lassosul, clapele și brațele care stabilizează capsida P74-26 necesită un capsomer mai mare pentru a funcționa. Este posibil ca lassosul să aibă nevoie de spațiu suplimentar pentru a se deschide suficient pentru ca o structură de cârlig să se insereze. De asemenea, este posibil ca flapsurile și brațele să aibă nevoie de o anumită lungime pentru a-și declanșa activitatea de stabilizare. Dacă acesta ar fi cazul, atunci elementele arhitecturale care stabilizează capsida necesită capsomeri mai mari decât cei normali. În acest scenariu, capsomerul mai mare este caracteristica structurală selectată, iar geometria T = 7 este un spandrel: o structură biologică care este mai degrabă un produs secundar al evoluției decât un rezultat al selecției directe68. Cu toate acestea, nu favorizăm această ipoteză, deoarece lassomerii se găsesc în herpesvirusuri, în care pliul HK97 are o dimensiune tipică (MCP-urile herpesvirusurilor au alte câteva domenii turn care măresc dimensiunea, dar aceste domenii nu fac parte din etajul principal al capsidei și nu contribuie la pliul HK9749). Mai mult, alte MCP de caudovirus conțin brațe N lungi (de exemplu, fagul Sf631) sau bucle E care sunt deschise aproape la fel de larg ca P74-26 (de exemplu, fagul P2243), dar aceste proteine au o dimensiune tipică. Cu toate acestea, această ipoteză rămâne netestată.

O a doua ipoteză este că dimensiunea genomului și capacitatea capsidei au coevoluat prin mici creșteri concomitente. Dacă fagul ancestral a evoluat cu un genom puțin mai mare decât poate fi găzduit în capsidă, atunci poate exista o presiune selectivă pentru o capsidă puțin mai mare. Creșterea numărului de T sau trecerea la un cap prolatat crește substanțial volumul capsidei, ceea ce duce la scăderi mari ale presiunii interne. Aceste tranziții pot fi descurajate, deoarece presiunea internă trebuie menținută pentru infectare26. Pentru a evita schimbările mari ale presiunii interne, capsomerii mai mari pot coevola lent cu un genom mai mare.

Ipoteza noastră finală este că geometria capsidului are un efect direct asupra stabilității generale a capsidului. Noi presupunem că geometria T = 7 este în mod inerent mai stabilă decât numerele de triangulație mai mari, datorită conformațiilor variabile ale hexonilor. Toate capsidele care sunt T = 9 sau mai mari au mai multe tipuri de hexoni prezenți, în timp ce toate capsidele T ≤ 7 au exact un singur tip de hexon (cu excepția T = 1, care nu are hexoni69,70). De exemplu, T = 7 are o conformație hexonică cu o singură aripă, în timp ce T = 9 are atât hexoni înaripați, cât și plat (Fig. suplimentară 11a, b). De asemenea, observăm că capsidele prolate au mai multe tipuri de hexoni (în general, trei sau mai multe conformații de hexoni; Fig. 9). Astfel, proteinele majore ale capsidei în virusurile T > 7 trebuie să se adapteze la eterogenitatea conformațională a hexonilor, ceea ce poate afecta negativ stabilitatea.

Potrivim ipoteza că geometria T = 7 este cea mai mare complexitate (adică cea mai mare dimensiune) care este inerent stabilă. Geometrii mai complexe ar introduce instabilitate prin variația în conformația hexonului. Această instabilitate inerentă ar putea necesita mecanisme suplimentare de stabilizare pentru a o atenua, cum ar fi proteinele de decorare pentru a cimenta structura la locul ei. Avem în vedere două dezavantaje care nu se exclud reciproc ale geometriei T > 7. În primul rând, fiecare dintre conformațiile separate ale hexonului trebuie să rămână funcțională și stabilă, ceea ce ar constrânge evoluția proteinelor MCP pentru o mai mare stabilitate. Al doilea beneficiu este că un număr mai mic de triangulații are ca rezultat mai puține interfețe subunitate-subunitate, minimizând astfel numărul de puncte slabe în capsidă. În sprijinul acestei ipoteze, virusul arheal extremofilic HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) își împachetează genomul de ~68 kb într-o capsulă T = 771. HSTV-2 utilizează o capsidă mai mare decât în mod normal și are, de asemenea, proteine de decorare trimerice care se află la axele de trei ori/trei ori cvasi-trei ori. Faptul că acest mecanism de mărire a capsidei a fost observat numai la extremofile susține ideea că geometria T = 7 are un efect benefic asupra stabilității. În sprijinul ipotezei noastre, toate capsidele T > 7 cunoscute folosesc proteine de decorare (după cunoștințele noastre), în timp ce multe virusuri T = 7 nu au proteine de decorare.

Dacă diferite numere de triangulație au o stabilitate inerentă diferită, acest lucru ar sugera că fiecare geometrie prezintă puncte slabe în diferite regiuni ale capsidei, așa cum a fost prezis din lucrările teoretice72. Noi presupunem că axele triplu/cuplu cvasi-triplu reprezintă punctele slabe într-o rețea T = 7. În sprijinul acestei ipoteze, proteinele de decorare ale caudovirusurilor T = 7 se regăsesc în mod obișnuit la axele triplu/triplu cvasi-triplu (tabelul suplimentar 2)29,44,52. Mai mult, aceste axe sunt stabilizate prin legături încrucișate covalente în cazul fagului HK9745 și prin clapetele de buclă T în cazul P74-26 (Fig. 7b). Pentru a examina în continuare această idee, observăm că fagii T = 9 utilizează, de asemenea, proteine de decorare la axele triplu73,74, în timp ce fagii T = 12 și T = 13 utilizează proteine de decorare la centrele capsomerilor61,75,76.

Reținem că toate analizele noastre s-au axat în principal pe Caudovirusuri. Aceste virusuri nu își descompun, în general, capsidele ca parte a ciclului lor de viață, astfel încât capsida nu are o presiune selectivă pentru a fi labilă. De fapt, presiunea ridicată a ADN-ului împachetat prezintă o presiune selectivă ridicată pentru a evolua capside stabile. Este probabil ca și alte tipuri de virusuri să utilizeze mecanisme de stabilitate diferite, în special virusurile care își dezasamblează capsidele ca parte necesară a ciclului lor de viață.

.