3.1.2 Azider
Azider anses vara en av de mest lämpade grupperna för bioorthogonala reaktioner och klickkemi. Till skillnad från keton och aldehyd finns det knappast några azider som förekommer i biologiska system. Azider har hög inneboende energi men ingen naturlig reaktionspartner (King och Wagner, 2014), har små storlekar och neutral total laddning, och slutligen är de kinetiskt stabila under fysiologiska förhållanden.
Staudinger-ligeringen (Staudinger och Hauser, 1921) verkar vara en bra kandidat för biokonjugationsreaktioner med azider. I denna reaktion reagerar azider med trifenylfosfinreagenser som innehåller en elektrofil fälla för att producera en aza-ylidintermediat som reagerar med den elektrofila esterkarbonylgruppen och bildar en femmastjärnig ring som genomgår hydrolys för att generera en slutlig stabil amidbindning (fig. 5.6A) (Steen Redeker et al., 2013; Staudinger och Hauser, 1921). En ny variant av denna reaktion beskrevs kort därefter (King och Wagner, 2014; Saxon och Bertozzi, 2000; Saxon et al., 2000; Nilsson et al., 2000), kallad ”spårlös Staudinger-ligering”, där den slutliga amidbundna produkten frigörs från fosfinoxiddelen.
Figur 5.6. Exempel på biokonjugationsreaktioner med azider. (A) Staudingerligering, (B) kopparkatalyserad azid-alkynecykloaddition, (C) stampromoverad azid-alkynecykloaddition, (D) cykloaddition med oxanorbornadiener. UAA, onaturliga aminosyror.
Staudinger-ligeringen har använts i en mängd olika tillämpningar. Raines et al. tillämpade till exempel denna reaktion som cysteinfritt alternativ till NCL för peptidligering (Nilsson et al., 2001) och i kombination med NCL vid sammansättning av artificiellt RNAas A (Nilsson et al., 2005). Dessutom användes den i andra tillämpningar, t.ex. proteinimmobilisering på fast underlag för avbildning in vitro och in vivo (Saxon och Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), märkning av biomolekyler in vitro och in vivo (Saxon och Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), proteinberikning (Vocadlo et al., 2003) och detektion (Charron et al., 2009) samt (Lemieux et al., 2003) proteinmodifiering.
Några nackdelar med Staudinger-ligeringen. Nämligen dess långsamma kinetik (andra ordningens hastighetskonstant i det låga intervallet 10-3 M-1s-1) (Lin et al, 2005), fosfinföreningarnas oxidationslabilitet (man måste använda relativt höga koncentrationer av fosfinreagenset) och fosfinernas potentiella korsreaktivitet med disulfider (Lang och Chin, 2014; King och Wagner, 2014).
Azider kan reagera med alkyner i en Cu(I)-katalyserad azid-alkyncykloaddition (CuAAC) eller 1,3-dipolär cykloaddition (Fig. 5.6B), ett av de mest standardiserade exemplen på klickkemireaktioner (Rostovtsev et al, 2002; Tornøe et al., 2002). Denna reaktion är av stort intresse inom biologiska vetenskaper på grund av dess goda selektivitet, höga utbyte och milda reaktionsförhållanden (rumstemperatur i olika lösningsmedel). Dessutom införs både azider och alkyner i proteiner utan att påverka proteinets struktur och funktion (Steen Redeker et al., 2013). Aziden och alkynen kan mycket snabbt bilda en stabil 1,2,3-triazolbindning under fysiologiska förhållanden i närvaro av Cu(I). Den mekanism som föreslagits av Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) beskriver först införandet av den terminala alkynen i en kopparacetylid och en efterföljande attack av aziden (King och Wagner, 2014). Nyligen har denna mekanism förfinats ytterligare och en dikopparintermediär har föreslagits (Worrell et al., 2013). De största nackdelarna med denna reaktion är de Cu(I)-beroende sidoreaktionerna och Cu(I)-cytotoxiciteten (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), vilket har begränsat dess tillämpning främst för märkning i det extracellulära rummet (King och Wagner, 2014). CuAAC har använts i stor utsträckning i många olika biologiska studier, till exempel för att märka fosfolipider för deras avbildning in vivo (Jao et al., 2009) och in vitro (Neef och Schultz, 2009), för att ombilda virusytor (Steinmetz et al, 2009), för att modifiera/märka proteiner in vitro och in vivo (Link och Tirrell, 2003; Ngo och Tirrell, 2011; Liu och Schultz, 2010; Deiters et al., 2003), för att märka nukleinsyror (Weisbrod och Marx, 2008) och för affinitetsbaserad sondeprofilering (Speers et al., 2003).
Differentierade metoder har utvecklats för att övervinna kopparens cytotoxicitet. Nämligen användning av vattenlösliga ligander för Cu(I)-koordinering, användning av kopparkapslande organiska azider och införande av ringspänning i alkyndelen. I det första fallet samordnar de vattenlösliga liganderna Cu(I) för att bilda en aktiverad kopparkatalysator som kan främja CuAAC vid låga mikromolära koncentrationer av metallen och samtidigt minska den potentiella toxiciteten hos Cu(I) (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo och Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). I det andra fallet höjs den effektiva Cu(I)-koncentrationen vid reaktionsstället genom att använda azidligander som innehåller en intern kopparkelaterande del (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). Den sista strategin innebär användning av alkyner, som har aktiverats för att reagera med förbättrad kinetik i avsaknad av katalysator. I detta avseende ökar användningen av cyklooktyndelar reaktiviteten till följd av att ringspänningen frigörs (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). Den stamfrämjande azid-alkynecykloadditionen (SPAAC) (fig. 5.6C) har blivit ett kraftfullt verktyg inte bara för protein- och antikroppsmärkning utan även för andra tillämpningar, t.ex. antikroppsfri Western Blot-analys (Boutureira et al., 2015), eftersom ytterligare reagenser eller giftiga metaller som kan skada biomolekylerna inte behövs. Bertozzi et al. har till exempel bevisat dess tillämplighet vid modifiering av renade proteiner (Baskin et al., 2007). I ytterligare experiment tillämpades reaktionen framgångsrikt in vitro på fibroblastceller (Baskin et al., 2007). Vidare användes SPAAC för att avbilda tumörer i levande möss med hjälp av nanopartiklar (Koo et al., 2012) och 18F PET där fluoret var knutet till både azid och cykloalkyne (Jeon et al., 2012). Andra tillämpningsområden hittades inom virusmodifiering och DNA-märkning (Qiu et al., 2013). Den komplexa syntesen av cyklooktaner och det faktum att deras ökade bulkighet och hydrofobicitet kan påverka proteinstrukturen och stabiliteten (Kim et al, 2013) och att deras ökade aktivering kan främja sidoreaktioner med naturligt förekommande tioler kan betraktas som nackdelar.
Elektronbristande sulfonylazider kan också reagera med aktiverade alkener (oxanorbornadiener eller norbornener) i en metallfri cyklokladdning (fig. 5.6D), som liknar SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Produkten av azid-alkencykloadditioner är dock en relativt instabil triazolin till skillnad från de aromatiska triazoler som bildas i den klassiska klickcykloadditionen. En oxanorbornadien som är både spänd och elektronfattig användes som dipolarofil i en reaktion med azider (van Berkel et al., 2008). I detta fall reagerar den ansträngda dubbelbindningen i oxanorbornadien med azider för att bilda en intermediär triazolin som spontant genomgår en retro Diels-Alder-reaktion, med frisättning av furan, vilket leder till stabila 1,2,3- eller 1,4,5-triazoler. Denna reaktion användes för att selektivt biokonjugera ett oxanorbornadienfunktionaliserat protein och en azidmodifierad cyklisk peptid i vattenbuffertar. Även om oxanorbornadiener är lättare att syntetisera än deras motsvarigheter till cyklooktyne, är denna cycloadditionsreaktion ganska långsam och inte helt kemoselektiv med avseende på andra funktionella grupper som finns i proteiner, vilket kan ha begränsat dess utbredda användning (Lang och Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).