Free Press

Introduktion

För att kunna erbjuda adekvat mat och näring till den globala befolkningen, som förväntas uppgå till 9 miljarder människor år 2050 (http://www.unpopulation.org), måste avkastningen av ris öka med minst 60 % (FAO 2009). Ris är basföda för över hälften av världens befolkning och denna risförbrukande befolkning ökar med 1,098 % per år (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). En ökande befolkning innebär ökad efterfrågan på livsmedel, vatten och mark vid en tidpunkt då naturresursbasen för jordbruket försämras eftersom stora arealer jordbruksmark överförs från livsmedelsproduktion till industrialisering och produktion av biobränsle. En oförutsägbar klimatförändring hotar att ytterligare minska jordbruksbar mark på grund av fler fall av torka och översvämningar (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Eftersom en växande befolkning och globala klimatförändringar sätter allt större press på världens livsmedelsförsörjning är det viktigt att vi fortsätter att förbättra grödornas prestanda när det gäller spannmålsproduktivitet för att hålla jämna steg med befolkningstillväxten. Den ökade produktiviteten hos grödorna tack vare de växttyper som skapades under den gröna revolutionen gav stöd åt befolkningsökningen efter de två världskrigen. Sedan dess har avkastningspotentialen för dagens risodlingar, trots användningen av förbättrade sorter och avancerad teknik, bara förbättrats en aning, vilket tyder på att dessa sorter har nått ett avkastningstak (Akita 1994). Nyligen gjordes ett försök att öka risets avkastningspotential genom att konstruera en effektiv fotosyntes av C4-typ i riset (Kajala et al. 2011). För detta måste en uppsättning gener som reglerar bladens anatomi och biokemiska processer införas i riset och uttryckas på ett lämpligt sätt, vilket för närvarande inte är möjligt enbart med konventionella växtförädlingsmetoder. Därför skulle genteknik för att förbättra risets fotosyntesväg ge tillräckliga möjligheter att öka den faktiska spannmålsproduktiviteten och avkastningspotentialen. Genteknik är ett effektivt och exakt förädlingsverktyg där endast de gener som är av intresse kan introduceras, även från avlägset besläktade arter.

I C3-växter som ris assimileras koldioxid till en 3-kolförening av det fotosyntetiska enzymet ribulos-1, 5-bisfosfatkarboxylasoxygenas (Rubisco). Som namnet antyder katalyserar Rubisco också oxidation av ribulos-1, 5-bisfosfat (RuBP) i en slösaktig process som kallas fotorespiration och som kan medföra en förlust av upp till 25 % av det tidigare bundna kolet (Sage 2004). Vid temperaturer över 30 °C, vilket är typiskt för tropiska risodlingsområden i världen, ökar syresättningen avsevärt, vilket avsevärt minskar den fotosyntetiska effektiviteten hos C3-växter med upp till 40 % (Ehleringer och Monson 1993). Fotosyntesen hos ris i tropikerna och de varma tempererade områdena blir därför ineffektiv. C4-växter som har en mekanism för koncentration av koldioxid i sina blad har mycket lägre nivåer av fotorespiration och har därför utvecklats för att trivas i varma, torra miljöer och erbjuder värdefulla insikter för förbättringsstrategier för grödor. Ris med en C4-fotosyntesmekanism skulle öka fotosyntesens effektivitet och samtidigt använda knappa resurser som mark, vatten och gödningsmedel, särskilt kväve, mer effektivt (Hibberd et al. 2008). Eftersom C4-riset kommer att fungera bra vid höga temperaturer och kräver mindre vatten och kväve, skulle C4-riset ge fördelar för olika typer av risekosystem, inklusive marginella marker.

C4-fotosyntes är en av de tre typer av biokemiska mekanismer som växter använder sig av för att binda koldioxid i atmosfären, de andra är C3- och Crassulaceans syrametabolism (CAM). C4-fotosyntesen har utvecklats mer än 66 gånger oberoende av varandra (Sage et al. 2012), åtminstone i 19 familjer under angiospermernas utveckling från C3-förfäder (Muhaidat et al. 2007), och den innebär förändringar av cellstrukturer, biokemi och därmed av bladens utveckling. Denna högt specialiserade form av fotosyntes har i huvudsak utvecklat en koldioxidkoncentrerande mekanism runt enzymet Rubisco, vilket eliminerar Rubiscos oxygenasfunktion och därmed minskar energiförlusten på grund av fotorespiration (Douce och Heldt 2000). Rubisco från C4-arter är effektivare än från C3-arter när det gäller karboxylering (Kubien et al. 2008). Andra fördelar med C4-systemet är bland annat högre vattenanvändningseffektivitet eftersom en brantare koncentrationsgradient för CO2-diffusion kan upprätthållas genom delvis stängda klyvöppningar, högre strålningsanvändningseffektivitet eftersom C4-fotosyntesen inte blir mättad vid hög ljusintensitet (Rizal et al. 2012) och högre kväveanvändningseffektivitet eftersom det krävs mindre Rubisco och därmed mindre kväve.

C4-växter är potentiellt mer produktiva vid högre temperaturer, som riset vanligen utsätts för. För att dra nytta av detta effektivare fotosyntetiska system i en tid då befolkningen och livsmedelspriserna stiger kraftigt, görs ansträngningar för att föra in C4-mekanismen, som den som finns i majs, i ris (Rizal et al. 2012). Detta nya tillvägagångssätt för att modifiera fotosyntesen i ris är en utmanande och långsiktig strävan eftersom C4-systemet är mycket komplext och många faktorer som styr mekanismen fortfarande är okända. Därför krävs det uppfinningsrikedom och expertis av forskare som är involverade i olika discipliner, t.ex. genteknik, biokemi, bioinformatik, molekylärbiologi, fotosyntes, systembiologi, fysiologi, växtförädling, metabolomik osv. Därför har C4-konsortiet för ris utformats och inrättats, som sedan 2009 påbörjat det praktiska arbetet med C4-risteknik (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Denna översikt ger en uppdatering av kraven för att utveckla C4-ris och de framsteg som gjorts inom genteknikområdet. Baserat på studien av utvecklingen av C4 från C3-arter och de tillhörande förändringarna är följande modifieringar nödvändiga för att etablera en funktionell C4-fotosyntesväg i ris.

Öka antalet och storleken på kloroplasterna i buntskivecellerna hos ris

I ris är mer än 90 % av de totala kloroplasterna lokaliserade i mesofyllcellerna (MC) i bladet (Yoshimura et al. 2004), medan i C4-växter både MC och buntskiveceller (BSC) har lika många kloroplaster (figur 1A och B). Detta beror på att i C3-plantor sker hela fotosyntesprocessen i MC, men i C4-plantor är fotosyntesprocessen uppdelad i MC och BSC. MC:erna utför den första CO2-fixeringen där det bildas en 4-karbonförening som kallas oxaloacetat, som omvandlas till C4-syror som malat som transporteras till BSC:erna, vilket möjliggör en effektiv assimilering av CO2 till kolhydrater genom Calvin-cykeln i BSC:erna. Till skillnad från C3-växter har BSC i C4-växter fotosyntetiska funktioner, t.ex. dekarboxylering av C4-föreningar och Calvincykelprocessen. För att utföra dessa processer är BSC:erna i C4-växter förstorade och har fler kloroplaster, vilket gör BSC:erna mer utpräglade och fotosyntetiskt aktiva. BSC i C3-arter fungerar för att balansera det hydrauliska trycket, förhindra att luft tränger in från intercellulära utrymmen till xylemet, tillhandahålla en reservoar av vatten för att buffra förluster på grund av transpiration, möjliggöra inträde och spridning av högre ljusintensitet som träffar venerna in i bladet (Nikolopoulos et al. 2002). Ytterligare funktioner hos BSC i C3-växter inkluderar transport av kväve, svavel, kolhydrater och roll i signalvägar som har granskats utförligt i (Leegood 2008). Hos C4-arter samarbetar BSC och MC i en tvåstegsversion av fotosyntesen. För att säkerställa en direktkontakt mellan BSC och MC har C4-växter därför en speciell typ av bladanatomi som åtföljs av spridning av kloroplaster i BSC. För att införa C4-vägen i ris krävs fler fotosyntetiska kloroplaster i BSC:erna än vad riset har nu. Detta kan göras genom att överuttrycka de genetiska element som är nödvändiga för kloroplastutvecklingen, t.ex. Golden2-liknande (GLK)-gener, på ett cellspecifikt sätt med hjälp av C4-genpromotorer, t.ex. fosfenolpyruvatkarboxylas (PEPC) från Zea mays för MC-specifikt uttryck och fosfenolpyruvatkarboxykinas (PCK)-promotorn från Zoysia japonica för BSC-specifikt uttryck i risblad (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Golden2-like (GLK) genfamiljemedlemmar kodar för nukleära transkriptionsfaktorer som har varit inblandade i regleringen av kloroplastutvecklingen i Arabidopsis, Zea mays och mossan Physcomitrella patens (Rossini et al. 2001). I var och en av dessa arter finns GLK-gener som ett homologt par med namnen GLK1 och GLK2 (Waters et al. 2009). I mossan och Arabidopsis är GLK-generna redundanta och funktionellt likvärdiga medan GLK-generna i majs och sorghum agerar på ett celltypsspecifikt sätt för att styra utvecklingen av dimorfa kloroplaster (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). I majs ackumuleras Golden2 (G2) och dess homolog ZmGLK1-transkript främst i BS- respektive M-celler, vilket tyder på en specifik roll för varje gen som reglerar den dimorfa kloroplastdifferentieringen (Wang et al. 2013a).

Reducera venavståndet och därmed öka ven-tätheten i bladet

Inom C3-arter sker fotosyntesen i MC:erna. Ett stort antal MC:er mellan de på varandra följande venerna (figur 1A) gör att venerna hamnar långt ifrån varandra, vilket ökar venavståndet eller minskar vendetätheten. I risblad finns det mindre än 6 vener per mm (figur 2A), Setaria viridis och sorghum (båda är typiska C4-arter) har mer än 7 vener per mm (figur 2B och C). C4-blad har i genomsnitt 2 MCs mellan venerna (figur 1B). Den högre vendetätheten i C4-växternas blad leder till ett nästan ett till ett förhållande mellan volymerna av M- och BS-vävnader. Den inre anatomin hos ett C4-blad består ofta av ett upprepande mönster av ven-BS-M-M-M-BS-vein. BSC:er omgivna av MC:er bildar en kransliknande struktur; denna typ av bladanatomi kallades för ”Kranz-anatomi” av den tyske botanikern G. Haberlandt. C4 BSC har tät cytoplasma och är fyllda med ett stort antal kloroplaster (figur 1B). För att C4-systemet ska fungera effektivt är en nära kontakt mellan M- och BS-cellerna oundgänglig, och dessa är tätt sammankopplade med varandra genom ett stort antal plasmodesmata Dengler och (Nelson 1999). Kranz anatomi finns med liten variation i nästan alla monokotyledoner och dikotyledoner som använder C4-fotosyntesvägen med två celler. Studier av bladens anatomi och morfologi har avslöjat flera gener som är ansvariga för tillväxt, utveckling eller missbildningar av celler i bladen. En gen ACAULIS1 var ansvarig för bladcellernas förlängning (Tsukaya et al. 1993). Mutation i genen CURLEY LEAF (CLF) gav upphov till krulliga blad i Arabidopsis (Kim et al. 1998). Ökning av fria venändar, öppet venationsmönster och rundad bladstruktur orsakades av rotunda 1 (RON1) (Robles et al. 2010). Mutation i Scarecrow-genen i majs visade en ökning av antalet BSC:er, en ovanlig differentiering av BS-kloroplasten, en minskning av de mindre venerna och en förändring av vendetätheten (Slewinski et al. 2012). Dessa studier som rör den onormala venmönstringen som orsakas av mutation av vissa gener ger en viss ledtråd om hur Kranz-anatomin regleras och tyder på att flera vägar är inblandade i utvecklingen av Kranz-mönstret. Regleringsnätverket SCARECROW/SHORTROOT har fastställts vara en av de viktiga komponenter som krävs för mönstring av Kranz-anatomin eftersom bladen hos C3-plantor med muterad Scarecrow-gen var normala, medan i C4-plantor mutation i samma gen skadade Kranz-anatomin (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Nyligen har det visats att införandet av majskromosomer i havre kunde öka BSC-storleken och minska venavståndet i C3-havreblad, vilket visar att C3-bladens anatomi kan ändras (Tolley et al. 2012). Dessutom har stora ansträngningar gjorts för att screena sorghum (C4) mutanter med ökat venavstånd och ris (C3) mutanter med minskat venavstånd så att de gener som kontrollerar egenskapen venavstånd kan identifieras (Rizal et al. 2012).

Calvincykelns aktivitet bör vara betydligt reducerad i MC och kraftigt förstärkt i BSC hos ris

C4-fotosyntesen kännetecknas av en biokemisk CO2-pumpningsmekanism som höjer koncentrationen av CO2 vid platsen för Rubisco. En hög nivå av koldioxid runt Rubisco minskar fotorespirationen och ökar nettokoncentrationen av koldioxid, vilket leder till en mycket effektiv fotosyntes Weber och von (Caemmerer 2010). För att uppnå detta fördelas CO2-assimileringen i C4 på två celltyper, MC:s och BSC:s (figur 3). Därför beror C4:s koldioxidfixering på cellspecifikt genuttryck och lokalisering. De närliggande fotosyntetiskt aktiva BS- och M-cellerna interagerar för att eliminera Rubisco-katalyserad O2-fixering. I tvåcelliga C4-växter av typ C4 fixeras koldioxid först till C4-syran som benämns oxaloacetat i MC:erna av ett O2-okänsligt karboxylas som kallas fosfenolpyruvatkarboxylas (PEPC, EC 4.1.1.31). Oxaloacetat omvandlas sedan till malat eller aspartat och transporteras till BSC där det dekarboxyleras och koldioxid frigörs. Denna koldioxid fixeras på nytt av Rubisco och alla efterföljande aktiviteter i Calvincykeln äger rum i kloroplasten i BSC:erna (Nelson och Langdale 1989). För att få ett fungerande C4-ris måste därför Rubiscoaktiviteten minskas kraftigt i MC:s och ökas i BSC:s, vilket begränsar Calvincykeln till BSC:s i riset, precis som i ett C4-system. Å andra sidan måste vissa gener som kodar för C4-enzymer, t.ex. β-kolsyreanhydras (CA) och PEPC, överuttryckas i cytosolen i risets MC för att underlätta den primära CO2-fixeringen så att CO2 kan koncentreras och tillföras Rubisco i BSC. C4-cykeln inbegriper också en omfattande transport av metaboliter genom kloroplastens hölje och plasmalemma i MC och BSC (figur 3). Förutom de centrala C4-enzymerna CA, PEPC, pyruvat ortofosfat (Pi)dikinas (PPDK, EC 2.7.9.1), NADP-beroende malatdehydrogenas (NADP-MDH, EC 1.1.1.1.82) och NADP-beroende malicenzym (NADP-ME, EC 1.1.1.1.40), C4-vägen kräver också att metabolittransportörer för oxaloacetat, malat, triosefosfat och pyruvat införs i riset för att ge ökad transportkapacitet för C4-cykelns intermediärer så att Calvin-cykeln kan fungera effektivt i BSC:erna (Weber och von Caemmerer 2010).

Fotorespirationen i mesofyllcellerna måste minskas kraftigt

I C3-växter sker kolfixering och Calvincykeln i MC:erna. Under kolfixeringen reagerar ribulos-1,5-bisfosfat (RuBP) – en förening med fem kol, katalyserad av ett enzym ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylasoxygenas (Rubisco, EC.4.1.1.1.39) med koldioxid för att bilda två molekyler av en förening med tre kol som kallas 3-fosfoglycerat (3-PGA). I Calvincykeln bildar de två PGA-molekylerna en energirik sockermolekyl (triosfosfat) och regenererar RuBP för nästa cykel. Vid nuvarande koncentrationer av koldioxid i atmosfären (ca 400 ppm) katalyserar Rubisco också en reaktion mellan RuBP och O2, vilket resulterar i en molekyl vardera av 2-fosfoglykolat och 3-PGA (Peterhansel och Maurino 2011). 2-fosfoglykolatet måste omvandlas tillbaka till 3-PGA genom den process som kallas fotorespiration och som omfattar en rad biokemiska reaktioner. Under denna process sker en förlust av tidigare fixerat kol och kväve och extra energi måste också användas (Sharpe och Offermann 2013).

C4-växter har utvecklat mekanismer för att begränsa lokalisering och aktiviteter av Rubisco i BSC. MCs förhindrar rumsligt kontakten mellan Rubisco i BSCs och O2 i de intercellulära utrymmena, vilket förhindrar energiförlust genom fotorespiration. Att C4-växter eliminerar fotorespiration framgår av deras mycket låga CO2-kompensationspunkt, som är nästan noll, och deras konstant höga karboxyleringseffektivitet (CE) utan att reagera på förändringar i O2-koncentrationerna (figur 4). I C3-växter däremot, med en förändring av O2-koncentrationen från 21 % till 2 %, minskade kompensationspunkten avsevärt från 55 till 30 ppm (tabell 1). I figur 4 beräknades CE enligt (Li et al. 2009) som visade att CE hos sorghum inte förändrades signifikant med förändringen av O2-nivån, men hos ris fanns det en mycket signifikant förbättring av CE när O2-nivån minskade från 21 till 2 % (figur 4 och tabell 1). Ökningen av CE i sorghum var bara 6,1 % medan ökningen i ris var 41,5 % när den intercellulära O2-koncentrationen minskade till 2 % (tabell 1). Dessa uppgifter visar att det finns en stor potential att öka risets fotosyntetiska kapacitet genom att minska fotorespirationen, vilket i sin tur skulle öka avkastningen avsevärt. Ett sätt att minska fotorespirationen i MC är att minska proteinet glycin-dekarboxylas (GDC) i MC och begränsa dess ackumulering i BSC så att dekarboxyleringen av glycin uteslutande sker i BSC, vilket genererar en högre koldioxidkoncentration i BSC, liknande den i C3-C4-intermediärer (Monson och Rawsthorne 2000). C4-konsortiet för ris testar detta tillvägagångssätt genom att använda artificiellt mikroRNA som utformats mot risets GDC-H-underenhet och som drivs av ZmPEPC-promotorn (Kajala et al. 2011). En sådan biokemisk mekanism kräver cellulär specialisering av BSC:erna, vilket inkluderar en ökning av antalet kloroplaster och mitokondrier som berikar organellinnehållet i risets BSC:er för att hjälpa till att återfånga den koldioxid som frigörs genom GDC:s dekarboxylering av glycin (Ueno 2011). Ett annat tillvägagångssätt som var framgångsrikt för att fånga upp den koldioxid som frigörs genom fotorespiration till fotosyntesen är genom överföring av Escherichia coli glykolat katabolisk väg till kloroplaster av Arabidopsis thaliana där glykolat i kloroplasterna direkt omvandlades till glycerat (Kebeish et al. 2007). Denna strategi, som minskade fotorespirationen och ökade fotosyntesen i Arabidopsis, innebar en stegvis nukleär transformation med fem bakteriegener riktade mot kloroplasten som kodar för glykolatdehydrogenas, glyoxylatkarboligas och tartroniskt semialdehydreduktas, skulle kunna tillämpas på andra C3-växter, t.ex. ris, men det kan hända att användningen av bakteriegener inte är att föredra vid konstruktionen av C4-ris.

Engineering av C4-vägen i ris

Det var tänkt att C4-systemet med enstaka celler skulle vara snabbare att installera i C3-plantor. Det finns försök att konstruera C4-fotosyntessystem i en cell även i ris (Miyao et al. 2011). För att införa en encellig C4-liknande väg där MC görs för att fånga och frigöra koldioxid på samma sätt som det sker i Hydrilla verticillata (L.f) Royle, överproducerades fyra enzymer (PEPC, PPDK, NADP-MDH och NADP-ME) som är involverade i vägen i de transgena risbladen (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Några av de stora problem som uppstått och som måste lösas för att skapa en encellig C4-liknande väg i ris är följande: mekanism för att underlätta transport av PEP över kloroplasthöljet, import av OAA till kloroplasterna och riktningen för NADP-ME-reaktionen, inblandning av NADP-MDH, närvaron av endogen PEPC i risets MC-kloroplast och ytterligare höjning av NADP-MDH-aktiviteten rapporterades vara nödvändig (Miyao et al. 2011). Jordiska encelliga C4-arter som Bienertia cycloptera, B. sinuspersici och Suaeda aralocaspica, som tillhör Chenopodiaceae-familjen, behöver också en rumslig uppdelning av kolassimilering och dekarboxylering (Chuong et al. 2006). Dessa arter har dimorfa kloroplaster i dessa kompartment. De tidigare försöken producerade en meningslös cykel vilket berodde på att det inte skedde någon förändring i anatomin, att det saknades lämpliga transportörer och att de majsgener som transformerades till ris inte uttrycktes på lämpligt sätt på ett cellspecifikt sätt och att de inte reglerades som i majs utan reglerades som de endogena C3-isoformerna i ris (Miyao et al. 2011).

För att konstruera fotosyntesvägen från C3 till C4 inom två decennier, vilket tog miljontals år i naturen, inledde C4 ris-konsortiet den samtidiga genupptäckten och konstruktionen av redan kända gener i ris i syfte att bilda C4-ris med anatomi av Kranz-typ. C4-gener som CA, PEPC, PPDK, NADP-ME och NADP-MDH klonas från majs och transformeras till ris. Även de transportörer som överuttrycktes i C4-metaboliska vägar, t.ex. 2-oxoglutarat/malattransportör (OMT1), dikarboxylattransportör1 (DiT1), dikarboxylattransportör2 (DiT2), PEP/fosfattransportör (PPT1), mesofyllhöljeprotein (MEP) och triosfosfatfosfattranslokator (TPT), som nyligen identifierades genom proteomik av majsens BS- och MS-celler (Friso et al. 2010) transformeras till ris (figur 3). Medlemmarna i C4-konsortiet för ris är också involverade i upptäckten av nya gener som är relaterade till Kranz-anatomin (Wang et al. 2013b). När de väl har testats kommer de lovande kandidatgenerna som kontrollerar Kranz-anatomin också att introduceras i de risplantor som har manipulerats med C4-biokemiska väggener.