Free Press

P74-26:s huvudkapsidprotein använder unika arkitektoniska egenskaper – lassos, ringar och klaffar – för att öka stabiliteten hos kapsiden. Vi observerar förstärkta hydrofoba interaktioner vid gränssnitten mellan underenheterna i kapsiden. De hydrofoba interaktionerna uppskattas vara >2 gånger högre för P74-26 än för andra mesofila homologer (kompletterande tabeller 3 och 4). Denna observation kan delvis förklara den förbättrade termostabiliteten hos P74-26 capsid, eftersom den hydrofoba effekten ökar i styrka vid hög temperatur32. Däremot observerar vi ingen signifikant förändring av antalet vätebindningar eller saltbryggor (kompletterande tabeller 3 och 4), andra interaktioner som har setts ge termostabilitet för vissa globulära proteiner33,34,35,36.

Vi var inte särskilt förvånade över att hitta ökade hydrofoba interaktioner i P74-26-kapsiden. Ett flertal studier av termofila globulära proteiner visar ökade hydrofoba krafter som en viktig bidragande faktor till termisk stabilitet33,37,38,39,40. Det finns dock två saker som gör P74-26 capsid till ett unikt modellsystem: (1) högt inre tryck från tätt paketerat DNA inducerar mekanisk stress i capsidet7,8,27 och (2) det är en självsammansatt struktur där arkitekturen och topologin mellan underenheterna spelar en viktig roll för den övergripande stabiliteten. Vi kan härleda dessa principer genom att jämföra P74-26:s struktur med många mesofila homologer.

Vi finner att P74-26:s capsid stabiliseras av flera slingor och förlängningar som bildar topologiska kopplingar mellan underenheterna. Den unika E-slingan lasso fäster vid G-slingan och P-domänen hos en angränsande MCP, som fungerar som en lift för att topologiskt binda fast lassot. Dessutom omsluter N- och C-armarna, tillsammans med Dec-armen, fullständigt E-loop β-strängarna, ett annat arkitektoniskt element som är unikt för P74-26 (fig. 5e). E-slingan är således ringad mot basen och lassoad mot spetsen.

En andra lasso bildas av N-armen, som bildar både intrakapsomer- och interkapsomerinteraktioner. N-armen binder till E-slingan hos en angränsande MCP inom en kapsomer genom den övre armsträngen, underarmshelixen och handregionen (fig. 5a, c). Vidare stabiliserar armbågen, underarmen och handen interaktioner mellan capsomer och capsomer genom att binda till DecP74-26 och en MCP-underenhet som ligger tvärs över de tvåfaldiga/kvasi-tvåfaldiga axlarna (fig. 6a, b). Även om N-armen tekniskt sett inte är en sluten slinga, sluter P74-26 effektivt slingan med hjälp av den unika S-slingan för att fixera positionen för underarms- och handregionerna (fig. 6c). Vi hittar ingen liknande lasso-arkitektur i N-armen hos mesofila Caudovirus31,41,42,43,44,45,46, vilket tyder på att denna arkitektur är viktig för att öka stabiliteten hos capsidet.

Och även om lassos inte hittas hos andra Caudovirus innehåller de avlägset besläktade herpesvirusen en analog lasso-arkitektur i N-armen av HK97-vecket47,48,49. I likhet med P74-26:s N-arm är herpesvirusens lassos i N-armen inte riktiga slutna slingor. Trots denna skenbara likhet fungerar herpesviruslassos på olika sätt. De stabiliserar uteslutande interkapsomerinteraktioner, medan P74-26:s N-arm-lasso stabiliserar både intrakapsomer- och interkapsomerinteraktioner. Dessutom uppvisar pentonerna i herpesviruskapsiderna inga lassointeraktioner och interaktionerna varierar inom hexonunderenheterna, medan P74-26 har nästan identiska lassointeraktioner i både pentonerna och hexonerna. Dessa observationer tyder på att lasso-arkitekturen sannolikt har utvecklats oberoende av varandra och belyser flexibiliteten hos topologiska stabiliseringsmekanismer. Vi antar att den förlängningsbara armarkitekturen underlättar evolutionen av starkare interaktioner inom självsammansättande system som t.ex. capsider. Dessa öppna slingor kan lätt förstärkas genom seriell förlängning av en enda residue. Kanske är denna lätthet i evolutionen orsaken till att förlängda armlassos finns i både P74-26 och herpesvirus. Dessa förlängda lassos liknar N- och C-terminala förlängningar som förmedlar sammansättning i andra virus (dvs. C-terminala förlängningar i SV40-kapsidens mantelproteiner50). Vi förväntar oss att dessa typer av förlängda lassos kan vara användbara för att konstruera stabilare capsider och andra självmonterande partiklar.

En annan fördel med lasso-arkitekturen är att den kan anta en mindre förlängd konformation. P74-26 MCP har två lassos i vardera änden av HK97-falsen, som förmodligen båda finns i den mycket mindre prokapsiden. Genom att använda dessa lassostrukturer kan P74-26 bibehålla hög stabilitet, samtidigt som den ger konformationell flexibilitet för att expandera under mognadsprocessen. Vi antar att lassorna är mindre utdragna i procapsidet; vid capsidets expansion når lassorna sin fulla utbredning, där de låser sig på plats. Den fulla förlängningen som observeras i den mogna kapsiden skulle ge spänningsintegritet, vilket vi diskuterar nedan.

P74-26 använder sammanvävda flikar för att topologiskt stabilisera kontakterna mellan kapsomererna. T-slingan stabiliserar interkapsomerinteraktioner genom att infoga sig i ett spår på P-domänen hos en MCP-underenhet i en angränsande kapsomer. Dessa T-slingainteraktioner återfinns runt de trefaldiga/kvasitrefaldiga axlarna längs capsidens insida (fig. 7b; kompletterande fig. 7b). På samma sätt stabiliseras de tvåfaldiga/kvasi-tvåfaldiga interaktionerna mellan kapsomererna på capsidens utsida av N-armarnas inbördes förskjutna arrangemang (fig. 7c; kompletterande fig. 7a). Dessa överlappande strukturer liknar det inbördes arrangemanget av flikar i toppen av en rörlig låda. På detta sätt stabiliseras capsidens yttre och inre ytor av två separata samverkande klaffinteraktioner. Vi föreslår att de rörliga lådarrangemangen som ses vid symmetri- och kvasisymmetriaxlar i hög grad stärker kapsidet mot inre tryck eftersom de är topologiskt utmanande att störa. Dessa arrangemang är dock förmodligen också utmanande att montera, vilket väcker den viktiga frågan om hur P74-26-kapsiden monteras med en interleaved arkitektur.

P74-26:s dekorationsprotein antar på samma sätt ett unikt strukturellt arrangemang, vilket i hög grad bidrar till kapsidens termostabilitet. Dekorationsproteiner ökar kapsidstabiliteten28,29,51 , även om ytterligare roller har postulerats52. De trefaldiga/kvasi-trefaldiga axlarna stabiliseras av trimern DecP74-26. Jämfört med mesofila Caudovirus interagerar DecP74-26-trimern med fler underenheter över ett mycket större interaktionsområde (fig. 8a). Det totala interaktionsområdet per DecP74-26-underenhet är ganska anmärkningsvärt: ~4100;Å2 för ett protein med 146 resider. Vår tidigare studie visade att DecP74-26 är betydligt stabilare än sina mesofila homologer, och denna stabilisering sker främst genom bildandet av en utomordentligt tät trimer23. Trimeriseringsinteraktionerna står dock bara för en liten del av det totala interaktionsområdet för DecP74-26 (~18 % av det totala interaktionsområdet per DecP74-26-underenhet). Detta tyder på att DecP74-26-interaktionen med kapsiden bidrar till en betydande del av stabiliteten.

Interaktioner mellan DecP74-26-trimers bildar en bur som håller ihop kapsiden (fig. 8b). Detta arrangemang är unikt för P74-26. Till exempel använder fagerna lambda och TW1 ett mycket likartat dekorationsproteinveck23, men interaktionen mellan deras Dec-arm och andra kapsidproteiner är mycket mer begränsad29,44. Dessutom ansluter det obesläktade dekorationsproteinet hos fag L inte till angränsande trimerer och saknas i själva verket vid de kvasitrimerade axlarna52. T4-fagen är dekorerad med Soc-proteinet som interagerar med angränsande Soc-underenheter vid de trefaldiga och kvasitrefaldiga axlarna; Soc finns dock i relativt låg beläggning (~50 %), så buren är ofullständig41. Eftersom dekorationsproteiner vanligtvis saknas i procapsid29 förväntar vi oss att DecP74-26-buren skulle samlas kooperativt vid capsidutvidgning för att stabilisera capsidet. Framtida experiment kommer att förhöra den roll som kooperativitet spelar för sammansättning och stabilitet.

De arkitektoniska förbättringarna i P74-26 MCP och Dec ger stabilisering mot högt internt tryck. Hur verkar krafter från internt tryck på kapsiden och hur motstår kapsidarkitekturen dessa påfrestningar? Om vi antar att trycket från inkapslat DNA fördelas jämnt runt den isometriska kapsiden, upplever alla punkter på kapsiden en kraftvektor som är vinkelrät mot kapsidens yta. Analogt kan man säga att kapsiden utsätts för krafter som liknar de krafter som en ballong utsätts för. Det inre trycket orsakar således laterala spänningar på interaktionerna mellan kapsidorna. Även om det höga inre tryck som fagen uppvisar utmanar capsidstabiliteten kan det möjliggöra stabilitetsmekanismer som bygger på tensegrity. Det är möjligt att det inre trycket kan utnyttjas för att producera en partikel som stabiliseras av stressen på de enskilda subenheterna. Som stöd för detta kan picornaviruskapsider, som kämpar med betydligt mindre internt tryck, stabiliseras genom mindre modifieringar av kapsiden53.

Arkitekturen hos P74-26-kapsiden är konstruerad för att motstå lateral stress genom tensional integritet. Spänningsintegritet, eller tensegrity, är en generaliserad mekanism för arkitektonisk stabilitet som innefattar strukturerade regioner som hålls samman av ett nätverk av flexibla element som är under kontinuerlig spänning54. I P74-26-kapsiden är A- och P-domänerna de strukturerade regionerna, och lassos och förlängda armar är de flexibla element som överför spänningar. Exempelvis kommer E-slingans lasso att bli spänt mot den kopplingspost som bildas av G-slingan och grannens P-domän. På samma sätt bildar N-armen ett lasso vars ände hålls på plats av S-slingan som låser sig i spåret mellan underarm och hand (fig. 6c). Vi förutspår alltså att S-slingan kommer att uppvisa kännetecknen för en catch-bindning, en icke-kovalent bindning som blir starkare under spänning55. Dessutom innehåller P74-26:s capsid flera flikar som är sammanlänkade med varandra. Dessa interaktioner skulle topologiskt motstå de laterala och longitudinella spänningarna från internt tryck. Som helhet använder dessa lasso- och klaffelement spänningar för att motstå strukturella fel på kapsiden. Den tensegrity-mekanism som observeras här är helt enkelt ett mer utarbetat exempel på kapsidens tensegrity som Caspar föreslog för många år sedan56.

Lasso-, klaff- och arminteraktionerna är placerade på ett sådant sätt att det inre trycket fördelar spänningen över flera bindningar. Till exempel upplever E-loop β-bladet krafter längs bladets axel. Således utsätts alla bindningar som håller ihop arket för spänningar snarare än den ortogonala geometrin där spänningarna bara finns på bindningarna i slutet av arket. Kapsidbrott skulle kräva att många bindningar bryts samtidigt (en skjuvningsgeometri), snarare än en upprivningsgeometri där bindningarna bryts en i taget57. Banbrytande studier av enskilda molekyler har visat att en skjuvningsgeometri kräver mycket högre krafter för att brytas än när krafterna verkar i en oskarvningsgeometri58,59,60. Således är P74-26:s capsid konstruerad så att laterala krafter verkar i en skjuvningsgeometri, vilket resulterar i hög tensegrity.

Förutom capsidens unika stabiliserande arkitektur antar P74-26 också en icke-kanonisk mekanism för att förändra capsidkapaciteten. Kapsiden hos P74-26 är större än hos de flesta Caudovirus, vilket korrelerar med dess onormalt stora genom. De flesta T = 7 Caudovirus har genomstorlekar på mellan 30 och 50 kb (kompletterande tabell 2), medan phage P74-26:s genom är nästan dubbelt så långt, 83 kb24. Baserat på genomstorleken hade vi förutspått att kapsidet skulle vara T = 12 (genomsnittlig genomstorlek ~80 kb61), även om T = 9 eller T = 13 skulle ha varit möjligt (genomsnittlig genomstorlek ~70 respektive ~120 kb). P74-26-kapsiden uppnår denna större storlek genom att avsevärt öka kapsomerstorleken snarare än att ändra den ikosaedriska komplexiteten. Kapsomern är större eftersom P74-26:s MCP täcker en större yta än normalt, trots en typisk längd för MCP. Följaktligen är capsomern något tunnare än normalt (fig. 4b). Antalet rester i MCP förutsäger alltså inte den totala yta som täcks, och genomstorleken förutsäger inte trianguleringsantalet.

Nyligen fastställde Bayfield et al.62 strukturen hos en närbesläktad T = 7 termofil fage, som på liknande sätt använder sig av förstorade capsomerare för att öka kapaciteten hos capsidet. Såvitt vi vet är detta en icke-kanonisk mekanism för att öka kapsidkapaciteten. Det finns två klassiska mekanismer för att förstora en capsid: (1) ökning av trianguleringsantalet och (2) omvandling av ett isometriskt till prolat huvud. I det första fallet läggs hexoner till på alla sidor av capsidet, medan hexoner i det andra fallet läggs till på tio av de isosaedriska sidorna så att capsidet förlängs i en dimension (fig. 9). I båda fallen förblir kapsidorna lika stora. Här har vi identifierat en tredje mekanism för evolutionen av en större capsid: att öka storleken på capsomern.

Dessa tre mekanismer har mycket olika evolutionära barriärer. De två klassiska mekanismerna kan genomföras genom enkla mutationer och har observerats många gånger. I många virus ändrar enkla punktmutationer trianguleringstalet5,63,64. Dessutom kan trianguleringstalet hos vissa kapsidor ändras utan att MCP-sekvensen ändras3,65,66. På samma sätt omvandlar enkla punktmutationer i T4-fagen kapsiden från prolat till isometrisk eller genererar jättehuvuden där den långa axeln på det prolata huvudet är förlängd4,67. Därför verkar de evolutionära hindren för att ändra capsidvolymen genom de två klassiska mekanismerna vara ganska låga. Däremot kräver den strategi med förstorade kapsomer som identifierats här flera omfattande förändringar av sekvenserna av kapsidproteiner. Den större P74-26-kapsiden kräver stora förändringar av de åtta separata modifieringarna av MCP-strukturen samt Dec-armen (fig. 3a, b och 4c, d). Detta väcker frågan: varför använde sig fag P74-26 av denna till synes mer utmanande evolutionära strategi i stället för de enklare, klassiska strategierna? Vilka begränsningar hindrade evolutionen av en större capsid genom de klassiska vägarna?

Vår första hypotes är att de lassos, flikar och armar som stabiliserar P74-26-kapsiden kräver en större kapsomer för att fungera. Det är möjligt att lassorna behöver extra utrymme för att kunna öppnas tillräckligt mycket för att en hittegodsstruktur ska kunna infogas. På samma sätt kan det hända att klaffarna och armarna behöver en viss längd för att kunna utöva sin stabiliserande funktion. Om så är fallet kräver de arkitektoniska element som stabiliserar kapsiden större kapsomer än normalt. I detta scenario är den större capsomern den utvalda strukturella funktionen och T = 7-geometrin är en spandrel: en biologisk struktur som är en biprodukt av evolutionen snarare än ett resultat av direkt urval68. Vi förordar dock inte denna hypotes eftersom lassos finns i herpesvirus, där HK97-vecket är en typisk storlek (Herpesvirus MCP:er har flera andra torndomäner som ökar storleken, men dessa domäner är inte en del av det huvudsakliga kapsidgolvet och bidrar inte till HK97-vecket49). Dessutom innehåller andra Caudovirus MCP:er långa N-armar (t.ex. Sf6-fag31) eller E-slingor som öppnas nästan lika brett som P74-26 (t.ex. P22-fag43), men dessa proteiner är av typisk storlek. Icke desto mindre förblir denna hypotes obeprövad.

En andra hypotes är att genomstorleken och kapsidkapaciteten samutvecklades genom små samtidiga ökningar. Om den ursprungliga fagen utvecklade ett något större genom än vad som kan rymmas i kapsiden kan det finnas ett selektivt tryck för en något större kapsid. Om man ökar T-antalet eller övergår till ett prolat huvud ökar kapsidvolymen avsevärt, vilket leder till stora minskningar av det inre trycket. Dessa övergångar kan avrådas eftersom det inre trycket måste bibehållas för att infektionen ska kunna ske26. För att undvika stora förändringar i det inre trycket kan större kapsider långsamt samevolvera med ett större genom.

Vår sista hypotes är att kapsidgeometrin har en direkt effekt på den totala kapsidstabiliteten. Vi antar att T = 7-geometrin i sig är stabilare än högre trianguleringstal på grund av variabla konformationer hos hexoner. Alla capsider som är T = 9 eller högre har mer än en typ av hexon närvarande, medan alla capsider T ≤ 7 har exakt en typ av hexon (utom T = 1, som inte har några hexoner69,70). T = 7 har till exempel en hexonkonformation med en enda pukorad hexonkonformation, medan T = 9 har både vingade och platta hexoner (kompletterande fig. 11a, b). Vi noterar också att prolata capsider har flera typer av hexoner (i allmänhet tre eller fler hexonkonformationer; fig. 9). De viktigaste kapsidproteinerna i T > 7-virus måste således ta hänsyn till hexonkonformationernas heterogenitet, vilket kan påverka stabiliteten negativt.

Vi antar att T = 7-geometrin är den högsta komplexiteten (dvs. största storleken) som är inneboende stabil. Mer komplexa geometrier skulle införa instabilitet genom variation i hexonkonformationen. Denna inneboende instabilitet kan kräva extra stabiliseringsmekanismer för att mildra den, t.ex. dekorationsproteiner för att cementera strukturen på plats. Vi ser två nackdelar med T > 7-geometrin som inte utesluter varandra. För det första måste var och en av de separata hexonkonformationerna förbli funktionell och stabil, vilket skulle begränsa evolutionen av MCP-proteiner för ökad stabilitet. Den andra fördelen är att ett lägre antal trianguleringar resulterar i färre gränssnitt mellan underenheter, vilket minimerar antalet svaga punkter i kapsiden. Som stöd för denna hypotes paketerar det extremtofila, arkealiska viruset HSTV-2 (Halorubrum sodomense tailed virus 2) sitt ~68 kb stora genom i ett T = 7 head71. HSTV-2 använder en kapsid som är större än normalt och har också trimeriska dekorationsproteiner som sitter vid de trefaldiga/kvasitrefaldiga axlarna. Det faktum att denna mekanism för kapsidförstoring endast har observerats hos extremofiler stöder idén att T = 7-geometrin har en fördelaktig effekt på stabiliteten. Som ytterligare stöd för vår hypotes använder alla kända T > 7-kapsider dekorationsproteiner (såvitt vi vet), medan många T = 7-virus saknar dekorationsproteiner.

Om olika trianguleringstal har olika inneboende stabilitet skulle detta tyda på att varje geometri uppvisar svaga punkter i olika regioner av kapsiden, vilket har förutsagts från teoretiskt arbete72. Vi antar att de trefaldiga/kvasitrefaldiga axlarna representerar de svaga punkterna i ett T = 7-gitter. Till stöd för denna hypotes finns dekorationsproteiner från T = 7 Caudovirus ofta vid de trefaldiga/kvasi-trefaldiga axlarna (kompletterande tabell 2)29,44,52. Dessutom stabiliseras dessa axlar av kovalenta tvärbindningar i HK97-fagen45 och T-loop-flappar i P74-26 (fig. 7b). För att undersöka denna idé ytterligare noterar vi att T = 9-fager också använder dekorationsproteiner vid de tredubbla axlarna73,74, medan T = 12- och T = 13-fager använder dekorationsproteiner vid centrumen av kapsomerer61,75,76.

Vi noterar att all vår analys i första hand har fokuserat på Caudovirus. Dessa virus bryter i allmänhet inte ner sina kapsidor som en del av sin livscykel, så kapsiden har inget selektivt tryck att vara labil. I själva verket utgör det höga trycket från förpackat DNA ett högt selektivt tryck för att utveckla stabila kapsidor. Det är troligt att andra typer av virus använder andra stabilitetsmekanismer, särskilt virus som bryter ner sina kapsidor som en nödvändig del av sin livscykel.