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Sei all’aeroporto a sprecare tempo con una relazione da consegnare domani mattina al tuo professore. Hai i tuoi dati. Perché non approfittare del tempo e calcolare il fold change di espressione per i geni che hai testato nel primo esperimento qPCR che hai fatto la settimana scorsa?

E’ facile – ti mostrerò come fare.

Controlla il tuo metodo

Ci sono due modi principali per analizzare i dati qPCR: analisi doppio delta Ct e il metodo della curva standard relativa (metodo Pfaffl). Entrambi i metodi fanno delle supposizioni e hanno i loro limiti, quindi il metodo che dovresti usare per la tua analisi dipenderà dal tuo progetto sperimentale.

L’analisi doppio delta Ct presuppone che:

• ci sia la stessa efficienza dei primer tra i set di primer (cioè entro il 5%);
• ci sia quasi il 100% di efficacia di amplificazione del riferimento e dei geni target;
• i geni di controllo interno sono costantemente espressi e non sono influenzati dal trattamento.

Il metodo generalmente si adatta a esperimenti con un gran numero di campioni di DNA e un basso numero di geni da analizzare.

Il metodo della curva standard relativa presuppone che:

• ci siano efficienze uguali tra i campioni di controllo e quelli trattati.

Questo metodo funziona meglio se si hanno meno campioni di DNA ma un numero maggiore di geni da testare.

Cosa ti serve per l’analisi Double Delta Ct

• I valori Ct dellaqPCR (dati grezzi) per:
  • il gene housekeeping: controllo e condizioni sperimentali;
  • il gene di interesse: controllo e condizioni sperimentali;
• un foglio Excel.

E questo è tutto! Nessun software costoso richiesto.

Ecco un rapido riassunto dei passi chiave nell’analisi del doppio delta Ct (per una spiegazione dettagliata leggere questo articolo).

4 passi per l’analisi del doppio delta Ct

1. Prendere la media dei valori Ct per il gene housekeeping e il gene da testare nelle condizioni sperimentali e di controllo, restituendo 4 valori. I 4 valori sono Gene testato sperimentale (TE), Gene testato di controllo (TC), Gene housekeeping sperimentale (HE) e Gene housekeeping di controllo (HC).

Valore medio Ct sperimentale	Valore medio Ct sperimentale	Valore medio Ct di controllo	Valore medio Ct di controllo	\DeltaCt (Sperimentale)	\Valore DeltaCt (Controllo)
TE	HE	TC	HC	\DeltaCTE	\DeltaCTC
21.27	20.23	19.60	19.27	1.03	0.33

2. Calcola le differenze tra i valori sperimentali (TE – HE) e quelli di controllo (TC – HC). Questi sono i tuoi valori \DeltaCt per le condizioni sperimentali (\DeltaCTE) e di controllo (\DeltaCTC), rispettivamente.

3. Poi, calcola la differenza tra i valori \DeltaCT per le condizioni sperimentali e di controllo (\DeltaCTE – \DeltaCTC) per arrivare al valore doppio delta Ct (ddCt).

4. Poiché tutti i calcoli sono in logaritmo base 2, ogni volta che c’è il doppio del DNA, i tuoi valori Ct diminuiscono di 1 e non si dimezzano. Devi calcolare il valore di 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} per ottenere l’espressione fold change.

Valore dCt (sperimentale)	Valore dCt (controllo)	Valore dCt	Valore di espressione
dCTE	dCTC	ddCt	2^-ddCt
1.03	0.33	0.70	0.615572207

Cosa significa il valore? Questo valore è il fold change del tuo gene di interesse nella condizione di test, rispetto alla condizione di controllo, che è stato normalizzato al tuo gene housekeeping.

Per renderlo un po’ più chiaro – puoi pensarlo come una percentuale. Un fold change di 1 significa che c’è il 100% di espressione genica nella tua condizione di test come nella tua condizione di controllo – quindi non c’è nessun cambiamento tra il gruppo sperimentale e il gruppo di controllo. Un valore di fold-change superiore a 1 mostra un’upregolazione del gene di interesse rispetto al controllo (1,2-fold change = 120% di espressione genica rispetto al controllo, 5 = 500%, 10 = 1.000%, ecc.) I valori inferiori a 1 sono indicativi della downregolazione del gene rispetto al controllo (un cambio di piega di 0,5 è il 50% di espressione del gene rispetto al controllo, quindi la metà dell’espressione rispetto al controllo, ecc. Puoi anche usare analisi statistiche per controllare la significatività dei cambiamenti, per esempio usando un’analisi della varianza (ANOVA) o t-test, qualsiasi cosa sia appropriata per il tuo set-up sperimentale!

Utilizzando questi passaggi puoi condurre la tua analisi qPCR ovunque tu sia, anche se sei in viaggio. Per rendere le cose ancora più facili, è possibile creare un modello Excel da utilizzare ogni volta. Poi dovrai solo inserire i tuoi dati e stupirai gli altri con la tua alacrità nel condurre le analisi!

Originariamente pubblicato il 9 luglio 2016. Rivisto e aggiornato il 8 febbraio 2021.

Altre letture

Livak KJ, Schmittgen TD. Analisi dei dati di espressione genica relativa utilizzando RealTime Quantitative PCR e il 2^{-2\Delta\Delta C_{t}}. Metodo. Metodi. 2001;25:402-8.