Free Press

ÚVOD

Zvířecí modely hrají důležitou roli při vývoji léčiv a studiu molekulárně biologických mechanismů. Historicky model rakoviny kůže vyvolané uhelným dehtem u králíka podnítil vývoj myšího modelu vyvolaného karcinogenem. Byly vytvořeny různé zvířecí modely jako hodnotící nástroj pro predikci karcinogenů a zkoumání karcinogenních mechanismů (1). Přístup využívající chronickou expozici karcinogenu je však časově náročný a nákladný, což omezuje jeho použití při vývoji léčiv. Nicméně myší modely jsou stále atraktivnější než modely velkých zvířat, a to kvůli nízkým nákladům, snadné manipulaci a známé genetické informaci (2). V nedávné době byl vyvinut syngenní myší model, do kterého byly injikovány myší buněčné linie (3). Výhodami tohoto modelu jsou reprodukovatelnost, schopnost snadno indukovat různé typy nádorů a imunokompetence. Na druhou stranu tento model často vykazuje odlišnou odezvu ve srovnání s výsledky in vitro testů na lidských nádorových buňkách. K překonání této nevýhody použil National Cancer Institute (NCI) metodu, při níž jsou lidské nádorové buňky injikovány do imunodeficitní myši. Z osmi různých linií nádorových buněk NCI (mozek, tlusté střevo, leukémie, plíce, melanom, vaječníky, prostata a ledviny) byla vyvinuta baterie xenograftových modelů. Kromě toho byly zavedeny různé metody vytváření myších modelů pro hodnocení účinnosti a toxicity nových léčiv. Jedním z modelů je geneticky upravený myší model (GEMM), který je pokročilou metodou pro hodnocení mechanismů karcinogeneze a rezistence na léčiva (4). Pro model GEMM se používají imunokompetentní myši, podobně jako u syngenního modelu. Tento model tedy umožňuje aplikovat vývoj imunitních adjuvans pro nádorová onemocnění. Kromě toho je tento model užitečný pro objasnění biologických procesů a zkoumání nádorových buněk a jejich mikroprostředí, je však velmi nákladný, heterogenní a komplikovaný. V modelu GEMM se navíc četnost, vývoj a růst nádorů neshodují (4-7). Mnoho výzkumníků vymyslelo strategii preklinického hodnocení pro určení terapeutického potenciálu a napodobení lidského nádorového prostředí. Kromě modelu GEMM se v translačním výzkumu pro klinické studie používají in vivo xenotransplantační modely na athymických nahých myších a myších s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) pro implantaci lidských nádorových buněk nebo nádorové tkáně pacienta (8,9). V tomto přehledu jsou typy a charakteristiky nádorových xenotransplantačních modelů zaměřeny na využití při vývoji protinádorových léčiv.

Ektopický nádorový xenotransplantační model. Obecně se lidské nádorové buňky subkutánně injikují do zadní nohy nebo hřbetu myší (obr. 1A). V modelu ektopického nádorového xenograftu (ektopický model) se místo transplantace liší od původu kultivovaných buněk. Ektopický model je standardním modelem nádorového onemocnění používaným pro validaci a hodnocení v onkologických studiích. Po založení nádorových buněčných linií pro protinádorový screening v NCI byly vyvinuty xenotransplantační modely odvozené z těchto buněčných linií. Pro vytvoření xenotransplantačních modelů bylo použito šedesát buněčných linií odvozených z osmi orgánů a byly uvedeny informace, jako je doba zdvojení nádoru a míra tumorigenicity (1). V tabulce 1 je uvedeno, že u lidských nádorových buněčných linií byla míra reprodukovatelnosti xenotransplantačního modelu vyšší než 90 %. Pro hodnocení hlavních sloučenin získaných ze screeningového testu in vitro tento model prokázal, že stejné nádorové buňky mohou být užitečné a prediktivní, což je užitečné pro výběr použitelné nádorové sloučeniny pro převedení do klinického hodnocení.

Protože na ektopickém modelu lze snadno sledovat nádorovou aktivitu a růst nádoru, mnoho výzkumníků tento model využívá pro hodnocení protinádorové účinnosti (10-12). Objem nádoru (V) se vypočítá z největší délky a nejkratší délky nádoru (rovnice1). Z několika parametrů založených na těchto údajích lze vyhodnotit protinádorovou aktivitu. Využívá se poměr léčené skupiny (T) ke kontrolní skupině (C) (optimální % T/C), zpoždění růstu nádoru a regrese nádoru (13-15). Jako parametry toxicity byla stanovena úmrtí související s léčbou (DRD) a změna tělesné hmotnosti. DRD byl předpokládaný úhyn zvířat do 15 dnů a více než 20% úbytek tělesné hmotnosti léčených myší ve srovnání s kontrolou byl považován za nežádoucí účinek.

Tyto parametry pomáhají vyvodit hlavní sloučeninu ze screeningu léčiv. Příležitostně lze porovnat odpověď na léčivo v závislosti na typech rakoviny bez individuálních rozdílů, protože dva typy rakovinných buněk lze spontánně transplantovat do stejné myši a oba nádory mohou vykazovat rozdíly v růstu (16). Kromě toho je ektopický model velmi reprodukovatelný, homogenní a snadno použitelný.

Ne všechny nádory však lze použít jako nástroj hodnocení, protože některé nádory vykazují během nádorového bujení nekrózu a některé nádory nejsou solidní (nesubstanční). Imunosuprimované myši používané pro tvorbu zvířecích modelů představují jiné mikroprostředí než lidské nádorové onemocnění. Proto je hodnocení invaze a metastazování v tomto modelu omezené.

Ortotopický model xenograftu nádoru. Byly vyvinuty alternativní modely pro hodnocení citlivosti nádoru. Ortotopický model nádorového xenograftu (ortotopický model) je pokročilým nástrojem, který je však založen na imunosupresivním myším mikroprostředí. V ortotopickém modelu jsou lidské nádorové buňky transplantovány do stejného místa původu nádoru. Například buňky rakoviny plic byly pro ortotopický model přímo injikovány do myší plíce (obr. 1B). U tohoto modelu je k zajištění reprodukovatelnosti nutný dobře vyškolený odborník s chirurgickými dovednostmi. Míru záběru nádorového bujení je obtížné vypočítat, protože téměř všechny nádory s výjimkou melanomu jsou pouhým okem neviditelné. Ortotopické modely jsou navíc omezeny na měření růstu nádoru bez oběti na rozdíl od subkutánních ektopických modelů. Doposud je zobrazování zvolenou metodou pro sledování progrese rostoucích nádorů v ortotopických modelech. V současné době se ortotopické modely s nádorovými buněčnými liniemi exprimujícími fluorescenci nebo luciferázu sledují pomocí optického zobrazování, počítačové tomografie (CT) nebo magnetické rezonance (MRI) (17). K posouzení karcinogeneze a stanovení růstu nádoru bez obětí je zapotřebí nákladné vybavení, takže dostupnost tohoto modelu je omezená. Nicméně tento model je klinicky relevantní pro proces progrese podobný pacientovi (např. invaze). Podle zprávy Ho a jeho kolegů vykazují ortotopické nádory rychlejší růst nádoru v časné fázi, angiogenezi a hyperpermeabilitu cév ve srovnání s ektopickými nádory (18). U některých typů nádorů bylo rovněž pozorováno metastazování. Například ortotopický model nádoru implantovaného do tukového polštářku mléčné žlázy je také vhodným modelem pro karcinom prsu. V tomto modelu se spontánní metastázy nádoru podobají přirozenému vývoji lidského karcinomu prsu (19). Protinádorovou aktivitu a inhibici metastáz lze proto hodnotit na stejném modelu. Model metastáz je podrobně popsán níže.

Model metastázujícího karcinomu. Nádory, které vznikají lokálně působením ultrafialového a ionizujícího záření a karcinogenů, cirkulují v cévách a lymfatických uzlinách prostřednictvím invaze a způsobují metastázy (sekundární rakovinu) v místech, která jsou náchylná k invazi. Podle Pagetovy hypotézy semínka a půdy iniciuje primární nádorová buňka (semínko) metastázování ve vhodném prostředí (půdě), jako jsou plíce, játra, kosti, lymfa a mozek (20). Nedávný výzkum podnítil vývoj inhibitorů metastáz a preventivních léků založených na studiu mechanismů metastázování, ale dosud neexistoval nástroj pro preklinické hodnocení, který by definoval pokyny pro schválení klinické studie.

Pro vytvoření modelu metastáz byly vyvinuty různé metody a existují dva typy lidských xenograftových modelů. Za prvé, při ortotopické transplantaci dávají transplantovanénádorové buňky vzniknout primárnímu nádoru, nádor je odstraněn a poté je pozorováno metastazování. Například buňky melanomu WM239 byly transplantovány myším s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) a primární nádor byl izolován po 4 týdnech. Poté byly pozorovány plicní metastázy (21). Ortotopický model byl vytvořen z buněk karcinomu prostaty (DU145) a odstraněná lymfatická uzlina byla kultivována a izolované nádorové buňky byly znovu aplikovány myším, aby se získal model metastáz (22). Za druhé byly nádorové buňky intravenózně aplikovány nahým (obr. 1C) nebo SCID myším, kde cirkulovaly jako nádorové kmenové buňky a vyvolaly metastázování (23). Tento model vzniká rychleji než model první. Při křížení ektopického a ortotopického modelu se do ektopického místa subkutánně vstříknou fluorescenci exprimující buňky HT-29 (lidský karcinom tlustého střeva) a do tlustého střeva se transplantuje několik kusů nádorů odvozených z buněk HT-29 a poté se pozoruje metastazování (24). Obecně lze model metastáz snáze získat u SCID myší než u nahých myší. Protože metastázy, stejně jako u ortotopického modelu, je obtížné pozorovat vzhledově, s výjimkou případu rakoviny kůže (25), byly využity geneticky upravené buněčné linie (fluorescenční (24) nebo luciferázu exprimující buňky (26)) a sledovány pomocí optického zobrazování in vivo. Často se tento model používá pro termodiagnostiku, která zahrnuje zobrazování pomocí magnetické rezonance nebo pozitronové emisní tomografie (PET) (27) za účelem současné diagnostiky a stanovení vhodné protinádorové terapie. Dosud nebyly stanoveny pokyny pro používání metastáz jako nástroje hodnocení pro vývoj léčiv. Jsou zapotřebí další studie reprodukovatelnosti, mechanismů, které jsou základem metastáz, a markerů.

Nádorový xenograftový model odvozený od pacienta. Xenotransplantační modely mají přes své výhody omezenou schopnost prokázat, jak by pacient s nádorovým onemocněním reagoval na konkrétní léčbu. Je zapotřebí spolehlivě předpovědět odpověď na léčivo v klinickém hodnocení a současné modely nejsou dostatečné. Ve snaze odstranit nedostatky těchto modelů byl vyvinut a využíván xenotransplantát odvozený od pacienta (PDTX) (28,29). Protože PDTX zahrnuje transplantaci nádorové tkáně pacienta přímo do imunosuprimovaných myší (obr. 1D), genetické informace a imunohistologické markery jsou korelativní s pacientem a lze je použít k hodnocení nových protinádorových léčiv (30) a personalizované protinádorové terapie. Několik výhod PDTX lze shrnout následovně: 1

Model PDTX má však technická omezení a je nákladný a časově náročný. Především je třeba čerstvě vyříznuté primární lidské nádory dopravit z operačního sálu do laboratoře během několika hodin. Současně by měl být vzorek primárních lidských nádorů vyšetřen imunohistologickou analýzou. Proto je nutná spolupráce mezi chirurgem, histologem a výzkumným pracovníkem. Poté lze porovnat původní primární lidské nádory s nádorovou tkání pasážovaného tumorgraftu. Kromě toho je nutné schválení institucionální revizní komisí (IRB), protože využití nádorové tkáně získané od pacienta s sebou nese klinická a etická hlediska. Bez ohledu na toto úsilí je míra využití PDTX přibližně 25 % (31-33) a vytvoření PDTX trvá přibližně tři měsíce do první pasáže (údaje nejsou uvedeny). Stejně jako v případě transplantace xenoorgánů je nutné provést první transplantaci SCID myším, aby se zabránilo akutní imunorejekci, a to je nákladné. Kromě toho je objem nádorové tkáně získané od pacienta velmi omezený, takže počet populací PDTX by se měl zvyšovat pasážováním nádorové tkáně. současně by se každá pasáž nádorové tkáně měla histopatologicky analyzovat a porovnat s původní tkání. Od druhé pasáže lze použít nahé myši. Kousky nádorových tkání lze zmrazit a uchovat v tekutém dusíku.

I přes tyto překážky je zavedený model PDTX k dispozici pro ověřování citlivosti protinádorových léčiv a předpovídání prognózy pacientů. PDTX je jistě mimořádně slibným modelem pro personalizovanou léčbu nádorových onemocnění. V souladu s tím se světová výzkumná centra zabývají vytvořením banky zdrojů PDTX. V posledním desetiletí se model PDTX rychle rozvíjí. Tento model je slibným nástrojem pro vývoj protinádorových léčiv a prediktivních biomarkerů

.