Free Press

INTRODUCERE

Modelii de animale joacă un rol important în dezvoltarea medicamentelor și în studiile privind mecanismele biologice moleculare. Din punct de vedere istoric, modelul de cancer de piele indus de gudron de cărbune la iepure a declanșat dezvoltarea unui model de șoarece indus de carcinogen. Diferite modele animale au fost stabilite ca instrument de evaluare pentru predicția substanțelor cancerigene și investigarea mecanismelor cancerigene (1). Cu toate acestea, abordarea care constă în utilizarea expunerii cronice la un carcinogen necesită mult timp și este costisitoare, ceea ce limitează aplicarea sa în dezvoltarea de medicamente. Cu toate acestea, modelele de șoareci sunt în continuare mai atractive decât modelele de animale mari, datorită costurilor reduse, ușurinței de manipulare și informațiilor genetice cunoscute (2). Mai recent, a fost dezvoltat un model de șoarece singenic injectat cu linii celulare murine (3). Avantajele acestui model sunt reproductibilitatea, capacitatea de a induce cu ușurință diferite tipuri de tumori și imunocompetența. Pe de altă parte, acest model prezintă adesea un răspuns diferit în comparație cu rezultatele obținute în urma testelor in vitro pe celule canceroase umane. Pentru a depăși acest dezavantaj, Institutul Național de Cancer (NCI) a folosit o metodă prin care celulele canceroase umane sunt injectate într-un șoarece imunodeficient. A fost dezvoltată o baterie de modele de xenogrefe pornind de la opt linii diferite de celule canceroase NCI (creier, colon, leucemie, plămân, melanom, ovar, prostată și rinichi). În plus, au fost stabilite diverse metode de generare de modele de șoareci pentru evaluarea eficacității și toxicității noilor medicamente. Unul dintre modele este modelul de șoarece modificat genetic (GEMM), care este o metodă avansată pentru evaluarea mecanismelor de carcinogeneză și a rezistenței la medicamente (4). Pentru modelul GEMM se utilizează șoareci imunocompetenți, similar unui model singenic. Astfel, acest model permite aplicarea dezvoltării adjuvanților imuni pentru cancer. În plus, acest model este util pentru elucidarea proceselor biologice și pentru investigarea celulelor tumorale și a micro-mediului acestora, dar este foarte scump, eterogen și complicat. În plus, frecvența, dezvoltarea și creșterea tumorilor nu coincid în modelul GEMM (4-7). Mulți cercetători au conceput o strategie de evaluare preclinică pentru a determina potențialul terapeutic și pentru a imita mediul tumoral uman. În plus față de modelul GEMM, modelele de xenogrefe in vivo utilizează șoareci athimici nude și șoareci cu imunodeficiență combinată severă (SCID) pentru implantarea celulelor canceroase umane sau a țesutului tumoral al pacientului în cercetarea translațională în vederea studiilor clinice (8,9). În această trecere în revistă, tipurile și caracteristicile modelelor de xenogrefe tumorale sunt orientate spre utilizarea în dezvoltarea medicamentelor anticanceroase.

Model de xenogrefă tumorală ectopică. În general, celulele canceroase umane sunt injectate subcutanat în piciorul posterior sau în spatele șoarecilor (Fig. 1A). Într-un model de xenogrefă tumorală ectopică (model ectopic), locul de transplantare este diferit de originea celulelor cultivate. Modelul ectopic este modelul standard de cancer utilizat pentru validare și evaluare în studiile oncologice. După stabilirea liniilor de celule canceroase pentru screeningul anticancerigen în cadrul NCI, au fost dezvoltate modele xenograft derivate din aceste linii celulare. Șaizeci de linii celulare derivate din opt organe au fost utilizate pentru stabilirea modelelor de xenogrefe și au fost raportate informații precum timpul de dublare a tumorii și rata de tumorigenitate (1). În tabelul 1, în cazul liniilor celulare de cancer uman, rata de preluare reproductibilă a modelului xenograft a fost de peste 90%. Pentru evaluarea compușilor principali obținuți în urma unui test de screening in vitro, acest model a demonstrat că aceleași celule canceroase pot fi utile și predictive, ceea ce este util pentru selectarea unui compus oncologic aplicabil pentru transpunerea în studiul clinic.

Pentru că un model ectopic poate fi utilizat pentru a monitoriza cu ușurință tumorigenicitatea și creșterea tumorală, mulți cercetători au utilizat acest model pentru evaluarea eficacității anticancerigene (10-12). Volumul tumorii (V) este calculat din cea mai mare lungime și cea mai scurtă lungime a tumorii (Ecuația1). Din mai mulți parametri, pe baza acestor date, poate fi evaluată activitatea anticancerigenă. Au fost utilizate raportul dintre grupul tratat (T) și grupul de control (C) (% T/C optim), întârzierea creșterii tumorale și regresia tumorală (13-15). S-au determinat decesele legate de medicament (DRD) și modificarea greutății corporale ca parametri de toxicitate. DRD a fost presupus decesul animalelor în termen de 15 zile, iar o pierdere de peste 20% din greutatea corporală a șoarecilor tratați în comparație cu cea a șoarecilor de control a fost considerată un efect advers.

Acești parametri ajută la extragerea compusului principal din screeningul de medicamente. Ocazional, răspunsul la medicamente în funcție de tipurile de cancer ar putea fi comparat fără diferențe individuale, deoarece două tipuri de celule canceroase ar putea fi transplantate spontan în același șoarece, iar cele două tumori pot prezenta diferențe de creștere (16). În plus, modelul ectopic este foarte reproductibil, omogen și ușor de utilizat.

Cu toate acestea, nu toate tumorile pot fi utilizate ca instrument de evaluare, deoarece unele tumori prezintă necroză în timpul tumorigenității și unele tumori nu sunt solide (nesubstanțiale). Șoarecii imunodeprimați folosiți pentru realizarea modelelor animale reprezintă un micro-mediu diferit de cel al cancerului uman. Prin urmare, evaluarea invaziei și a metastazelor este limitată în acest model.

Model de xenogrefă tumorală ortotopică. Au fost dezvoltate modele alternative pentru evaluarea sensibilității tumorale. Modelul xenograftului tumoral ortotopic (model ortotopic) este un instrument avansat, dar se bazează pe un micro-mediu murin imunosupresor. În modelul ortotopic, celulele canceroase umane sunt transplantate în același loc de origine al tumorii. De exemplu, celulele canceroase pulmonare au fost injectate direct în plămânul de șoarece pentru modelul ortotopic (Fig. 1B). În acest model, este necesar un expert bine pregătit cu abilități chirurgicale pentru a asigura reproductibilitatea. Rata de preluare a tumorigenicității este dificil de calculat, deoarece aproape toate tumorile, cu excepția melanomului, sunt invizibile cu ochiul liber. În plus, modelele ortotopice sunt limitate la măsurarea creșterii tumorale fără sacrificii, spre deosebire de modelele ectopice subcutanate. Până în prezent, imagistica este metoda aleasă pentru a monitoriza evoluția tumorilor în creștere în modelele ortotopice. În prezent, modelele ortotopice cu linii de celule canceroase care exprimă fluorescența sau luciferaza sunt observate prin imagistică optică, tomografie computerizată (CT) sau imagistică prin rezonanță magnetică (IRM) (17). Pentru a evalua carcinogeneza și a determina creșterea tumorii fără sacrificii, sunt necesare echipamente costisitoare, astfel încât disponibilitatea acestui model este limitată. Cu toate acestea, acest model este relevant din punct de vedere clinic pentru procesul de progresie asemănător pacientului (de exemplu, invazia). Conform raportului lui Ho și al colegilor săi, tumorile ortotopice prezintă o creștere tumorală mai rapidă în stadii incipiente, angiogeneză și hiperpermeabilitate a vaselor de sânge în comparație cu tumorile ectopice (18). În unele tipuri de cancer, s-au observat, de asemenea, metastaze. De exemplu, modelul de implantare a tumorii pe plăcuța de grăsime mamară ortotopică este, de asemenea, un bun model pentru cancerul mamar. În acest model, metastazele tumorale spontane se aseamănă cu progresia naturală a cancerului de sân uman (19). Prin urmare, activitatea anticancerigenă și inhibarea metastazelor ar putea fi evaluate în același model. Modelul de metastază este descris mai jos în detaliu.

Model de cancer metastatic. Tumorile care se formează la nivel local prin expunerea la ultraviolete, radiații ionizante și agenți cancerigeni circulă în vase și ganglioni limfatici prin invazie, provocând metastaze (cancer secundar) în locurile care se pretează la invazie. Conform ipotezei seminței și solului lui Paget, celula canceroasă primară (sămânța) inițiază metastaza într-un mediu adecvat (solul), cum ar fi plămânul, ficatul, osul, limfa și creierul (20). Cercetările recente au stimulat dezvoltarea inhibitorilor de metastaze și a medicamentelor preventive pe baza studiilor privind mecanismele metastazelor, dar nu a existat un instrument de evaluare preclinică care să definească liniile directoare pentru aprobarea unui studiu clinic.

Pentru stabilirea unui model de metastază, au fost dezvoltate diverse metode și există două tipuri de modele de xenogrefe umane. În primul rând, în transplantul ortotopic, celulele tumorale transplantate dau naștere tumorii primare, tumora este îndepărtată și apoi se observă metastazele. De exemplu, celulele de melanom WM239 au fost transplantate în șoareci cu imunodeficiență combinată severă (SCID), iar tumora primară a fost izolată după 4 săptămâni. Apoi, a fost observată metastaza pulmonară (21). Modelul ortotopic a fost realizat din celule de cancer de prostată (DU145), iar ganglionul limfatic îndepărtat a fost cultivat și celulele tumorale izolate au fost reinjectate în șoareci pentru a obține un model de metastază (22). În al doilea rând, celulele canceroase au fost injectate intravenos în șoareci nude (Fig. 1C) sau SCID, unde au circulat ca celule stem canceroase și au declanșat metastaze (23). Acest model este generat mai rapid decât primul model. În hibridul dintre modelele ectopic și ortotopic, celulele HT- 29 (cancer de colon uman) care exprimă fluorescența sunt injectate subcutanat în locul ectopic și mai multe bucăți de tumori derivate din celule HT-29 sunt transplantate în colon, iar apoi se observă metastazele (24). În general, un model de metastază este mai ușor de obținut la șoarecii SCID decât la șoarecii nude. Deoarece metastazele, ca și în cazul modelului ortotopic, sunt dificil de observat în aparență, cu excepția cancerului de piele (25), au fost utilizate linii celulare modificate genetic (celule fluorescente (24) sau care exprimă luciferaza (26)) și monitorizate cu ajutorul imagisticii optice in vivo. În mod frecvent, acest model este aplicat pentru teragnostic, care implică imagistică prin RMN sau tomografie cu emisie de pozitroni (PET) (27) pentru a diagnostica și a determina simultan terapia anticancerigenă adecvată. Până în prezent, nu au fost stabilite liniile directoare privind utilizarea metastazelor ca instrument de evaluare pentru dezvoltarea de medicamente. Sunt necesare studii suplimentare privind reproductibilitatea, mecanismele care stau la baza metastazelor și markerii.

Model de xenogrefă tumorală derivată de la pacient. Modelele de xenogrefe, în ciuda avantajelor lor, sunt limitate în ceea ce privește capacitatea lor de a demonstra cum ar răspunde un pacient cu cancer la un anumit tratament. Este nevoie de o predicție fiabilă a răspunsului la medicamente în cadrul unui studiu clinic, iar modelele actuale nu sunt suficiente. Într-un efort de a aborda deficiențele acestor modele, a fost dezvoltată și utilizată o xenogrefă tumorală derivată din pacient (PDTX) (28,29). Deoarece PDTX implică transplantarea țesutului pacientului cu cancer direct în șoareci imunocompromiși (Fig. 1D), informațiile genetice și markerii imunohistologici sunt corelative cu pacientul și pot fi aplicate pentru a evalua noi medicamente anticancerigene (30) și terapii personalizate împotriva cancerului. Cele câteva avantaje ale PDTX pot fi rezumate după cum urmează: 1

Cu toate acestea, modelul PDTX are constrângeri tehnice și este costisitor și consumator de timp. Mai presus de toate, tumorile umane primare proaspăt extirpate trebuie să fie livrate din sala de operație în laborator în câteva ore. În același timp, un eșantion de tumori umane primare ar trebui să fie examinat prin analiză imunohistologică. Prin urmare, este necesar să existe o cooperare între chirurg, histolog și cercetător. Apoi, tumorile umane primare originale pot fi comparate cu țesuturile tumorale ale grefei tumorale pasagere. În plus, este necesară aprobarea unui consiliu de evaluare instituțională (IRB), deoarece utilizarea țesuturilor tumorale provenite de la pacienți implică considerente clinice și etice. În ciuda acestor eforturi, rata de absorbție a PDTX este de aproximativ 25 % (31-33), iar stabilirea PDTX durează aproximativ trei luni până la prima trecere (datele nu sunt prezentate). Ca și în cazul transplantului de xenoorgane, este necesar primul transplant la șoareci SCID pentru a scăpa de imunorejecția acută, iar acest lucru este costisitor. În plus, volumul de țesut tumoral derivat de la pacienți este foarte limitat, astfel încât numărul populației de PDTX ar trebui să fie crescut prin trecerea țesutului tumoral. în același timp, fiecare trecere a țesuturilor tumorale ar trebui să fie analizată histopatologic și comparată cu țesutul original. De la al doilea pasaj, pot fi utilizați șoareci nude. Bucățile de țesuturi tumorale pot fi congelate și conservate în azot lichid.

În ciuda acestor obstacole, modelul PDTX stabilit este disponibil pentru validarea sensibilității medicamentelor anticancerigene și pentru predicția prognosticului pacienților. PDTX este cu siguranță un model extrem de promițător pentru terapia personalizată a cancerului. În consecință, centrele de cercetare la nivel mondial sunt preocupate de crearea unei bănci de resurse de PDTX. În ultimul deceniu, modelul PDTX a cunoscut o dezvoltare rapidă. Acest model este un instrument promițător pentru dezvoltarea medicamentelor anticancerigene și a biomarkerilor predictivi.