Free Press

INTRODUCTION

Eläinmalleilla on tärkeä rooli lääkekehityksessä ja molekyylibiologisten mekanismien tutkimuksessa. Historiallisesti kivihiilitervan aiheuttama ihosyöpämalli kaniinissa käynnisti karsinogeenin aiheuttaman hiirimallin kehittämisen. Erilaisia eläinmalleja on luotu arviointivälineeksi karsinogeenien ennustamiseen ja karsinogeenisten mekanismien tutkimiseen (1). Krooninen altistuminen syöpää aiheuttavalle aineelle on kuitenkin aikaa vievää ja kallista, mikä rajoittaa sen käyttöä lääkekehityksessä. Hiirimallit ovat kuitenkin edelleen houkuttelevampia kuin suuret eläinmallit, koska ne ovat edullisia, helppokäyttöisiä ja niiden geneettinen informaatio tunnetaan (2). Viime aikoina on kehitetty syngeeninen hiirimalli, johon on ruiskutettu hiiren solulinjoja (3). Tämän mallin etuja ovat toistettavuus, kyky indusoida helposti erilaisia kasvaintyyppejä ja immunokompetenssi. Toisaalta tämä malli osoittaa usein erilaista vastetta verrattuna in vitro -tutkimusten tuloksiin ihmisen syöpäsoluilla. Tämän epäkohdan poistamiseksi National Cancer Institute (NCI) käytti menetelmää, jossa ihmisen syöpäsoluja ruiskutetaan immuunipuutteiseen hiireen. Kahdeksasta eri NCI:n syöpäsolulinjasta (aivo-, paksusuoli-, leukemia-, keuhko-, melanooma-, munasarja-, eturauhas- ja munuaissyöpäsolulinjat) kehitettiin ksenograft-malleja. Lisäksi on luotu erilaisia menetelmiä hiirimallien tuottamiseksi uusien lääkkeiden tehon ja toksisuuden arvioimiseksi. Yksi malli on geneettisesti muunnettu hiirimalli (GEMM), joka on kehittynyt menetelmä karsinogeneesimekanismien ja lääkeresistenssin arvioimiseksi (4). GEMM-mallissa käytetään immunokompetentteja hiiriä, jotka muistuttavat syngeenistä mallia. Tämä malli mahdollistaa siis immunologisen adjuvanttikehityksen soveltamisen syövän hoitoon. Lisäksi tämä malli on hyödyllinen biologisten prosessien selvittämisessä sekä kasvainsolujen ja niiden mikroympäristön tutkimisessa, mutta se on hyvin kallis, heterogeeninen ja monimutkainen. Lisäksi kasvainten esiintymistiheys, kehitys ja kasvu eivät osu yksiin GEMM-mallissa (4-7). Monet tutkijat ovat kehittäneet strategian prekliinistä arviointia varten terapeuttisen potentiaalin määrittämiseksi ja ihmisen kasvainympäristön jäljittelemiseksi. GEMM-mallin lisäksi in vivo-ksenotransplantaatiomalleissa käytetään nude-hiiriä ja SCID-hiiriä (severe combined immune deficiency) ihmisen syöpäsolujen tai potilaan kasvainkudoksen istuttamiseen translaatiotutkimuksessa kliinisiä tutkimuksia varten (8,9). Tässä katsauksessa keskitytään kasvaimen ksenograft-mallien tyyppeihin ja ominaisuuksiin ja niiden käyttöön syöpälääkkeiden kehittämisessä.

Ektooppinen kasvaimen ksenograft-malli. Yleensä ihmisen syöpäsolut ruiskutetaan ihon alle hiiren takajalkaan tai selkään (kuva 1A). Ektooppisen kasvaimen ksenograft-mallissa (ektooppinen malli) siirtokohta on eri kuin viljeltyjen solujen alkuperä. Ektooppinen malli on syöpäkasvaimen vakiomalli, jota käytetään validointiin ja arviointiin onkologisissa tutkimuksissa. Sen jälkeen, kun NCI:ssä oli perustettu syöpäsolulinjoja syöpälääkkeiden seulontaa varten, kehitettiin näistä solulinjoista johdettuja ksenograft-malleja. Ksenotransplanttimallien perustamiseen käytettiin kuudenkymmenen solulinjaa, jotka oli peräisin kahdeksasta elimestä, ja niistä raportoitiin tietoja, kuten kasvaimen tuplaantumisaika ja kasvainten lisääntymisaste (1). Taulukossa 1 on esitetty, että ihmisen syöpäsolulinjoissa ksenograft-mallin toistettavuusaste oli yli 90 prosenttia. In vitro -seulontatestistä saatujen johtavien yhdisteiden arvioinnissa tämä malli osoitti, että samat syöpäsolut voivat olla käyttökelpoisia ja ennakoivia, mikä on hyödyllistä sovellettavan syöpäyhdisteen valinnassa kliiniseen tutkimukseen siirtämistä varten.

Koska ektooppista mallia voidaan käyttää kasvaimen kasvainvaikuttavuuden ja kasvaimen kasvun seuraamiseen helposti, monet tutkijat ovat hyödyntäneet tätä mallia syövänvastaisen tehon arviointiin (10-12). Kasvaimen tilavuus (V) lasketaan kasvaimen suurimman pituuden ja lyhimmän pituuden perusteella (yhtälö1). Useista näihin tietoihin perustuvista parametreista voidaan arvioida syöpälääkkeen aktiivisuutta. Hyödynnettiin käsitellyn ryhmän (T) ja kontrolliryhmän (C) suhdetta (optimaalinen % T/C), kasvaimen kasvun viivästymistä ja kasvaimen taantumista (13-15). Lääkkeeseen liittyvät kuolemantapaukset (DRD) ja ruumiinpainon muutos toksisuuden parametreina määritettiin. DRD:llä tarkoitettiin eläinten kuolemia 15 päivän kuluessa, ja yli 20 %:n menetys käsitellyn hiiren ruumiinpainossa kontrolliin verrattuna katsottiin haitalliseksi vaikutukseksi.

Nämä parametrit auttavat vetämään johtavan yhdisteen lääkeseulonnasta. Toisinaan syöpätyypeistä riippuvaa lääkevastetta voitiin vertailla ilman yksilöllisiä eroja, koska kaksi syöpäsolutyyppiä voitiin siirtää spontaanisti samaan hiireen ja näissä kahdessa kasvaimessa voi olla kasvueroja (16). Lisäksi ektooppinen malli on hyvin toistettavissa, homogeeninen ja helppokäyttöinen.

Kaikkia kasvaimia ei kuitenkaan voida käyttää arviointivälineenä, koska joissakin kasvaimissa esiintyy nekroosia kasvaimen kasvaimellisuuden aikana ja jotkut kasvaimet eivät ole kiinteitä (epäsubstantiivisia). Eläinmallien tekemiseen käytettävät immunosuppressoidut hiiret edustavat erilaista mikroympäristöä kuin ihmisen syöpä. Siksi invaasion ja etäpesäkkeiden arviointi on tässä mallissa rajoitettua.

Ortotooppinen kasvaimen ksenograft-malli. Kasvaimen herkkyyden arviointiin on kehitetty vaihtoehtoisia malleja. Ortotyyppinen tuumoriksenograftimalli (ortotyyppinen malli) on kehittynyt väline, mutta se perustuu immunosuppressiiviseen hiiren mikroympäristöön. Ortotooppisessa mallissa ihmisen syöpäsolut siirretään samaan kasvaimen syntypaikkaan. Esimerkiksi keuhkosyöpäsolut injektoitiin suoraan hiiren keuhkoihin ortotyyppistä mallia varten (kuva 1B). Tässä mallissa tarvitaan hyvin koulutettua asiantuntijaa, jolla on kirurgiset taidot, jotta toistettavuus voidaan varmistaa. Kasvaimen ottonopeutta on vaikea laskea, koska melanoomaa lukuun ottamatta lähes kaikki kasvaimet ovat paljaalla silmällä näkymättömiä. Lisäksi ortotooppiset mallit rajoittuvat kasvaimen kasvun mittaamiseen ilman uhrauksia toisin kuin ihonalaiset ektooppiset mallit. Tähän mennessä kuvantaminen on valittu menetelmä, jolla seurataan kasvavien kasvainten etenemistä ortotooppisissa malleissa. Tällä hetkellä ortotooppisia malleja, joissa on fluoresenssia tai luciferaasia ilmentäviä syöpäsolulinjoja, tarkkaillaan optisella kuvantamisella, tietokonetomografialla (CT) tai magneettikuvauksella (MRI) (17). Karsinogeneesin arvioimiseksi ja kasvaimen kasvun määrittämiseksi ilman uhrauksia tarvitaan kalliita laitteita, joten tämän mallin saatavuus on rajallinen. Tämä malli on kuitenkin kliinisesti merkityksellinen potilaan kaltaisen etenemisprosessin kannalta (esim. invasiivisuus). Ho:n ja hänen kollegoidensa raportin mukaan ortotooppisissa kasvaimissa esiintyy nopeampaa kasvaimen alkuvaiheen kasvua, angiogeneesiä ja verisuonten hyperläpäisevyyttä verrattuna ektooppisiin kasvaimiin (18). Joissakin syöpätyypeissä havaittiin myös etäpesäkkeitä. Esimerkiksi ortotyyppinen maitorauhaskasvaimen implantointimalli on myös hyvä malli rintasyövälle. Tässä mallissa kasvaimen spontaanit etäpesäkkeet muistuttavat ihmisen rintasyövän luonnollista etenemistä (19). Siksi syöpävaikutus ja etäpesäkkeiden esto voitaisiin arvioida samassa mallissa. Metastaasimalli kuvataan jäljempänä yksityiskohtaisesti.

Metastaattisen syövän malli. Kasvaimet, jotka muodostuvat paikallisesti altistumalla ultraviolettisäteilylle, ionisoivalle säteilylle ja syöpää aiheuttaville aineille, kiertävät verisuonissa ja imusolmukkeissa invaasion kautta aiheuttaen etäpesäkkeitä (sekundaarinen syöpä) paikoissa, jotka ovat alttiita invaasiolle. Pagetin siemen- ja maaperähypoteesin mukaan primaarinen syöpäsolu (siemen) käynnistää etäpesäkkeen sopivassa ympäristössä (maaperä), kuten keuhkoissa, maksassa, luussa, imusolmukkeessa ja aivoissa (20). Viimeaikaiset tutkimukset ovat vauhdittaneet metastaasin estäjien ja ennaltaehkäisevien lääkkeiden kehittämistä metastaasin mekanismien tutkimusten perusteella, mutta ei ole ollut olemassa prekliinistä arviointivälinettä, jonka avulla voitaisiin määritellä suuntaviivat kliinisen lääketutkimuksen hyväksyntää varten.

Metastaasimallin luomiseksi on kehitetty erilaisia menetelmiä, ja on olemassa kahdentyyppisiä ihmisen ksenotransplanttimalleja. Ensinnäkin ortotooppisessa siirrossa siirretyt kasvainsolut synnyttävät primaarikasvaimen, kasvain poistetaan ja sitten havaitaan etäpesäkkeitä. Esimerkiksi WM239-melanoomasoluja siirrettiin SCID-hiiriin (vaikea yhdistetty immuunipuutos), ja primaarikasvain eristettiin 4 viikon kuluttua. Sitten havaittiin keuhkojen etäpesäkkeitä (21). Eturauhassyöpäsoluista (DU145) tehtiin ortotooppinen malli, ja poistettua imusolmuketta viljeltiin ja eristetyt kasvainsolut ruiskutettiin uudelleen hiiriin metastaasimallin saamiseksi (22). Toiseksi syöpäsoluja ruiskutettiin suonensisäisesti nude- (kuva 1C) tai SCID-hiiriin, joissa ne kiertivät syöpäkantasolujen tavoin ja käynnistivät metastaasin (23). Tämä malli syntyy nopeammin kuin edellinen malli. Ektooppisen ja ortotooppisen mallin hybridissä fluoresenssia ilmentäviä HT- 29-soluja (ihmisen paksusuolisyöpä) ruiskutetaan ihon alle ektooppiseen kohtaan ja useita kappaleita HT-29-soluista peräisin olevia kasvaimia siirretään paksusuolelle, minkä jälkeen havaitaan etäpesäkkeitä (24). Yleisesti ottaen metastaasimalli saadaan helpommin SCID-hiirillä kuin nude-hiirillä. Koska etäpesäkkeitä on ortotooppisen mallin tapaan vaikea havaita ulkonäöltään, paitsi ihosyövän tapauksessa (25), käytettiin geneettisesti muunnettuja solulinjoja (fluoresenssisoluja (24) tai luciferaasia ilmentäviä soluja (26)), ja niitä seurattiin in vivo optisen kuvantamisen avulla. Tätä mallia sovelletaan usein diagnostiikkaan, johon kuuluu kuvantaminen magneettikuvauksella tai positroniemissiotomografialla (PET) (27), jotta voidaan samanaikaisesti diagnosoida ja määrittää sopiva syövän vastainen hoito. Tähän mennessä ei ole laadittu ohjeita metastaasin käyttämisestä lääkekehityksen arviointivälineenä. Tarvitaan lisätutkimuksia toistettavuudesta, metastaasin taustalla olevista mekanismeista ja merkkiaineista.

Potilaasta peräisin oleva kasvaimen ksenograft-malli. Ksenograft-mallit pystyvät eduistaan huolimatta vain rajoitetusti osoittamaan, miten syöpäpotilas reagoi tiettyyn hoitoon. Lääkevasteen luotettavaa ennustamista kliinisessä tutkimuksessa tarvitaan, eivätkä nykyiset mallit ole riittäviä. Näiden mallien puutteiden korjaamiseksi kehitettiin ja käytettiin potilasperäistä tuumoriksenograftia (PDTX) (28,29). Koska PDTX:ssä syöpäpotilaan kudos siirretään suoraan immuunipuutteisiin hiiriin (kuva 1D), geneettiset tiedot ja immunohistologiset merkkiaineet korreloivat potilaan kanssa, ja niitä voidaan käyttää uusien syöpälääkkeiden (30) ja yksilöllisten syöpähoitojen arviointiin. PDTX:n monet edut voidaan tiivistää seuraavasti: 1

PDTX-malliin liittyy kuitenkin teknisiä rajoituksia, ja se on kallis ja aikaa vievä. Ennen kaikkea juuri leikatut primaariset ihmisen kasvaimet on toimitettava leikkaussalista laboratorioon useiden tuntien kuluessa. Samanaikaisesti näyte ihmisen primaarikasvaimista olisi tutkittava immunohistologisella analyysillä. Siksi on välttämätöntä, että kirurgi, histologi ja tutkija tekevät yhteistyötä. Alkuperäisiä primaarisia ihmiskasvaimia voidaan sitten verrata passivoidun kasvainsiirteen kasvainkudoksiin. Lisäksi tarvitaan laitoksen arviointilautakunnan (IRB) hyväksyntä, koska potilaasta peräisin olevan kasvainkudoksen käyttöön liittyy kliinisiä ja eettisiä näkökohtia. Näistä ponnisteluista huolimatta PDTX:n ottoprosentti on noin 25 prosenttia (31-33), ja PDTX:n vakiintuminen kestää noin kolme kuukautta ensimmäiseen läpivientiin (tietoja ei ole esitetty). Kuten ksenoelinten siirroissa, ensimmäinen siirto SCID-hiirille on tarpeen akuutin immunorejektion välttämiseksi, ja tämä on kallista. Lisäksi potilaasta peräisin olevan kasvainkudoksen määrä on hyvin rajallinen, joten PDTX:n populaatiomäärää olisi lisättävä kasvainkudoksen läpikulun avulla. samanaikaisesti jokainen kasvainkudoksen läpikulku olisi analysoitava histopatologisesti ja verrattava alkuperäiseen kudokseen. Toisesta läpikäynnistä alkaen voidaan käyttää nude-hiiriä. Kasvainkudospalat voidaan pakastaa ja säilyttää nestemäisessä typessä.

Näistä esteistä huolimatta vakiintunut PDTX-malli on käytettävissä syöpälääkkeiden herkkyyden validointiin ja potilaiden ennusteen ennustamiseen. PDTX on varmasti erittäin lupaava malli yksilöllistä syöpähoitoa varten. Niinpä maailmanlaajuiset tutkimuskeskukset ovatkin huolissaan PDTX-resurssipankin perustamisesta. Viime vuosikymmenen aikana PDTX-malli on kehittynyt nopeasti. Tämä malli on lupaava väline syöpälääkkeiden ja ennakoivien biomarkkereiden kehittämiseen.