Du sidder i lufthavnen og bruger tiden på en rapport, der skal afleveres til din professor i morgen tidlig. Du har dine data. Hvorfor ikke udnytte tiden og beregne ekspressionsfoldændringen for de gener, du har testet i det første qPCR-eksperiment, du lavede i sidste uge?
Det er nemt – jeg viser dig hvordan.
Tjek din metode
Der er to hovedmetoder til analyse af qPCR-data: dobbelt delta Ct-analyse og den relative standardkurve-metode (Pfaffl-metoden). Begge metoder gør antagelser og har deres begrænsninger, så hvilken metode du skal bruge til din analyse, afhænger af dit forsøgsdesign.
Den dobbelte delta Ct-analyse forudsætter, at:
- der er samme primereffektivitet mellem primersættene (dvs. inden for 5 %);
- der er næsten 100 % amplifikationseffektivitet af reference- og målgenerne;
- de interne kontrolgener udtrykkes konstant og påvirkes ikke af behandlingen.
Metoden henvender sig generelt til eksperimenter med et stort antal DNA-prøver og et lavt antal gener, der skal testes.
Den relative standardkurve-metode forudsætter, at:
- der er lige stor effektivitet mellem kontrolprøverne og de behandlede prøver.
Denne metode fungerer bedre, hvis man har færre DNA-prøver, men et større antal gener, der skal testes.
Hvad du skal bruge til dobbelt delta Ct-analyse
- qPCR Ct-værdier (rådata) for:
- det husholdningsgen: kontrol- og forsøgsbetingelser;
- det interessante gen: kontrol- og forsøgsbetingelser;
- Et Excel-regneark.
Og det er det hele! Ingen dyr software påkrævet.
Her er et hurtigt resumé af de vigtigste trin i dobbelt delta Ct-analysen (for en detaljeret forklaring læs denne artikel).
4 trin til dobbelt delta Ct-analyse
1. Tag gennemsnittet af Ct-værdierne for det husholdningsgen og det gen, der testes i forsøgs- og kontrolbetingelserne, hvilket giver 4 værdier. De 4 værdier er genet, der testes eksperimentelt (TE), genet, der testes kontrol (TC), husholdningsgenet eksperimentelt (HE) og husholdningsgenet kontrol (HC).
| Gennemsnitlig eksperimentel Ct-værdi | Gennemsnitlig eksperimentel Ct-værdi | Gennemsnitlig kontrol Ct-værdi | Gennemsnitlig kontrol Ct-værdi | \DeltaCt-værdi (Eksperimentel) | \DeltaCt-værdi (Kontrol) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC | |
| 21.27 | 20,23 | 19,60 | 19,27 | 1,03 | 0,33 |
2. Beregn forskellene mellem de eksperimentelle værdier (TE – HE) og kontrolværdierne (TC – HC). Dette er dine \DeltaCt-værdier for henholdsvis forsøgsbetingelserne (\DeltaCTE) og kontrolbetingelserne (\DeltaCTC).
3. Beregn derefter forskellen mellem \DeltaCT-værdierne for forsøgs- og kontrolbetingelserne (\DeltaCTE – \DeltaCTC) for at nå frem til den dobbelte delta Ct-værdi (ddCt).
4. Da alle beregninger er i logaritmebase 2, vil dine Ct-værdier falde med 1 og ikke blive halveret, hver gang der er dobbelt så meget DNA, og de vil derfor ikke blive halveret. Du skal beregne værdien af 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} for at få udtrykket foldændring.
| dCt-værdi (eksperimentel) | dCt-værdi (kontrol) | ddCt-værdi | Ekspression Fold Change |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0,33 | 0,70 | 0,615572207 |
Hvad betyder værdien?
Nu, hvor du har din værdi for foldændring, hvad betyder den så egentlig? Denne værdi er foldændringen af dit gen af interesse i testbetingelsen i forhold til kontrolbetingelsen, som alle er blevet normaliseret til dit husholdningsgen.
For at gøre det lidt tydeligere – kan du tænke på det som en procentdel. En foldændring på 1 betyder, at der er 100 % lige så meget genekspression i din testbetingelse som i din kontrolbetingelse – der er altså ingen ændring mellem forsøgsgruppen og kontrolgruppen – der er altså ingen ændring mellem forsøgsgruppen og kontrolgruppen. En fold-change-værdi over 1 viser opregulering af det pågældende gen i forhold til kontrolgruppen (1,2-fold ændring = 120 % genekspression i forhold til kontrolgruppen, 5 = 500 %, 10 = 1.000 % osv.) Værdier under 1 er tegn på nedregulering af genet i forhold til kontrollen (foldændring på 0,5 er 50 % genekspression i forhold til kontrollen, altså halvt så meget ekspression som i kontrollen osv.).
Du kan præsentere disse data som søjlediagrammer med foldændring, hvor kontrolbetingelserne er lig med 1 i grafen. Du kan også bruge statistiske analyser til at kontrollere ændringernes betydning, f.eks. ved hjælp af en variansanalyse (ANOVA) eller t-test, alt efter hvad der passer til din forsøgsopstilling!
Med disse trin kan du udføre din qPCR-analyse, uanset hvor du befinder dig, selv hvis du er på en køretur. For at gøre tingene endnu nemmere kan du oprette en Excel-skabelon, som du kan bruge hver gang. Så behøver du kun at indtaste dine data, og du vil forbløffe andre med din hurtighed i udførelsen af analyser!
Originalt offentliggjort den 9. juli 2016. Revideret og opdateret den 8. februar 2021.
For yderligere læsning
Livak KJ, Schmittgen TD. Analyse af relative genekspressionsdata ved hjælp af realtidskvantitativ PCR og 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} Metode. Metoder. 2001;25:402-8.
Har dette hjulpet dig? Så del venligst med dit netværk.