Resultater

Imaging af cAMP i det primære cilium i levende celler ved hjælp af fluorescerende biosensorer giver flere unikke udfordringer. For det første er cilier små og slanke og rager 2-10 µm ud over cellens overflade; for det andet er de, selv om de ikke er bevægelige, udsat for bevægelse på grund af bulkstrømmen i badeopløsningen, og for det tredje kan ægte ciliesignaler være vanskelige at adskille optisk fra baggrundsfluorescens, der udgår fra cellekroppen. Mens flere cilium-målrettede cAMP-reportere tidligere er blevet beskrevet (19, 24, 25), søgte vi at generere ratiometriske biosensorer med forbedret lysstyrke og målretningsnøjagtighed. Efter at have testet adskillige designs fandt vi, at den bedste målretning, lysstyrke og følsomhed blev tilbudt af fjerde generations Epac-baserede prober fra Kees Jalink’s laboratorium (EpacH188 og en version med højere affinitet, EpacH187) (26) kombineret med Arl13b, et protein, der er stærkt lokaliseret til cilia (27) (Fig. 1A). Sensorer, der inkorporerer 5-HT6-receptoren, gav en forholdsvis god lokalisering som Arl13b-koblede prober; som diskuteret nedenfor forårsagede 5-HT6-receptorer, der ikke er lokaliseret til cilia, imidlertid forhøjelse af cellulær cAMP på grund af den velkendte konstitutive aktivitet af denne GPCR (28).

Fig. 4.

cAMP-signalering i cilia af digitonin-permeabiliserede celler. Alle eksperimenter blev udført i intracellulærlignende buffer suppleret med ATP og GTP. (A) mIMCD3-celler, der udtrykker 5-HT6-mCherry og Arl13b-H187 lokaliseret til både celle og cilium, reagerede ikke på 10 µM 5-HT i cellekroppen eller i ciliet efter 2 minutters behandling med 20 μg/mL digitonin (4 forsøg, 5 cilier). (B) Tilsvarende blev responsen på den omvendte agonist, 1 µM SB742457, og efterfølgende 5-HT6 rebound-respons tabt i både cellen og ciliet efter 2 min behandling med 20 μg/mL digitonin (3 forsøg, 3 cilia). (C) Digitonin-permeabilisering ophævede det 50 µM forskolin-inducerede cAMP-signal i cellekroppe, men cAMP-stigningen kunne påvises i cilier; 1 mM IBMX-induceret PDE-hæmning afmaskerede ikke noget signal (n = 4 forsøg med 4 cilier/7 celler). (D) AC3 cotransfection ændrede ikke forskolinsvaret. (E) Kvantificering og sammenligning af cAMP-respons på forskolin i cellekroppe og i cilia; **P = 0,0002, ***P = 00019. Blå spor = cellelegeme, røde spor = cilia. Tidsbjælker: 3 min. Y-aksen er forholdet 480/535 nm.

En indlysende forklaring på den manglende effekt i de foregående eksperimenter var, at cAMP ikke ophobede sig tilstrækkeligt til at blive fanget af reporteren. Men da det samme eksperiment blev gentaget ved hjælp af forskolin til direkte aktivering af endogene AC’er (adenylylcyklasser), der er til stede i ciliarmembranen, blev der påvist en lille, men konsekvent ophobning af cAMP i ciliums mikromiljø, men ikke i cellelegemet (fig. 4 C og E, venstre søjlediagrammer). Lignende resultater blev opnået i celler, der udtrykker AC3 (36) (Fig. 4 D og E, højre søjlediagrammer), som blev lokaliseret til cilia, når det blev udtrykt i mIMCD3-celler (SI Appendix, Fig. S8). Hvis man antager, at permeabilisering ikke førte til tab af væsentlige komponenter af GPCR-signalmaskineriet, tyder den lille, men påviselige ændring efter forskolintilsætning på, at det burde have været muligt at opløse GPCR-afhængige cAMP-signaler, hvis de fandt sted i ciliet. Disse data tyder også på, at ciliarmembranen i mIMCD3-cellerne blev efterladt intakt efter digitoninbehandling.

De foregående data efterlader os med spørgsmålet om, hvorfor GPCR’er ikke er kompetente til at producere cAMP, når de først er blevet afsondret i ciliet. Tidligere undersøgelser har nævnt Ca2+-indgang gennem ciliarmembranen som en vigtig regulator af organel cAMP på grund af tilstedeværelsen af cilia-specifikke Ca2+-ledende kanaler (PKD2L1 og PKD2) og Ca2+-regulerede AC’er (AC1, 8, 5 og 6) (11, 16, 23, 32, 37). Primære cilia af mIMCD3-celler er blevet rapporteret til at rumme Ca2+-inhiberbare AC5 og/eller AC6 (10). Vi overvejede derfor, at ciliernes høje hvile- og Ca2+-permeabilitet (38, 39) kunne forklare inaktiveringen af AC’er koblet til 5-HT6-receptoren. For bedre at behandle dette punkt forbedrede vi sensoren ved at erstatte Arl13b-målsekvensen med en funktionel 5-HT6-receptor for at målrette cAMP-reporter-GPCR-fusionen direkte til cilium (5-HT6-EpacH187). I overensstemmelse med dataene i fig. 3I og 4C gav 5-HT ikke noget målbart cAMP-signal, når det udelukkende var rettet mod ciliet, når det var rettet mod ciliet (fig. 5A). Eksponering af celler til nominelt Ca2+ -frie opløsninger reddede ikke 5-HT-responset i cilier (Fig. 5B), hvilket indikerer, at Ca2+ -indgang over ciliarmembranen ikke undertrykte signalet. Vi overvejede, at ekspression af 5-HT6 måske ændrede den ciliære fordeling af Gαs-proteinet i mIMCD3-celler, men immunfarveeksperimenter tyder på, at dette ikke er tilfældet (SI Appendix, Fig. S9). Da vi imidlertid testede effekten af 5-HT i celler, der var forbehandlet med SAG (250 nM til 1 µM) for at aktivere Smo-receptorer (40), var vi i stand til at genoprette 5-HT6-receptorens responsivitet over for agonisten (Fig. 5C). Sensitivitet over for den omvendte agonist var også tydelig, hvilket indebærer en genoprettelse af konstitutiv aktivitet (Fig. 5D).

Fig. 5.

Hedgehog pathway aktivering øger cAMP respons rapporteret af 5-HT6-Epac-H187 til 5-HT og dopamin i primære cilia: (A) I overensstemmelse med dataene i fig. 3I og 4C reagerede mIMCD3-celler ikke på 10 µM 5-HT, når sensor/receptorfusionen var begrænset strengt til ciliarmembranen (6 forsøg, 6 cilia). (B) At dæmpe den høje i cilia ved at placere cellerne i en nominelt Ca2+ fri opløsning reddede ikke 5-HT-stimuleret cAMP-signalering (5 eksperimenter, 6 cilia). (C) Efter forbehandling natten over med 1 µM SAG reagerede 5 ud af 6 cilia (6 eksperimenter) på 5-HT-stimulering (**P = 0,000992). (D) Forbehandling med 1 µM SAG reddede responset på 1 µM SB742257 (-35,5 ± 11,2 % under baseline i forhold til den efterfølgende cAMP-stigning fremkaldt af 10 µM 5-HT; typisk for 4 forsøg, 4 cilia). (E) En cAMP-stigning i NIH 3T3-cilia (typisk for 9 eksperimenter, 11 cilia) blev forårsaget af 10 μM 5-HT. (F) Forbehandling natten over med 1 μM SAG øgede 5-HT-responset signifikant (**P = 0,00034; 6 eksperimenter, 7 cilia). Forbehandling natten over med 10 μM cyclopamin (Cyclo) havde en ubetydelig virkning (8 eksperimenter, 9 cilier, søjlediagram). (G og H) 100 nM somatostatin (SST) svækkede 5-HT-respons i cilia, der har SSTR3-GFP med og uden SAG-forbehandling (G: 5 forsøg, 6 cilia; H: 2 forsøg, 5 cilia). (I og J) SAG-forbehandling øgede 10 nM dopamin (DA)-responset (I: 4 eksperimenter, 4 cilia, J: 4 eksperimenter, 6 cilia, **P = 0.002476). Blå spor, cellekrop; røde spor, cilia. Tidsbjælker: 3 min. Y-aksen er 480/535 nm FRET-forholdet. Søjlediagrammer angiver 5-HT- eller DA-responset som en procentdel af forskolin/IBMX-responset; fejlbjælker repræsenterer SEM.

De foregående resultater efterlod os med spørgsmålet om, hvorvidt den uventede SAG-afhængige opregulering af 5-HT6-receptoren udtrykt i mIMCD3-celler var celletype- og/eller GPCR-specifik. I modsætning til mIMCD3 producerede stimulering af 3T3-celler (Fig. 5E) og MEF’er (SI Appendix, Fig. S10A) med 5-HT en målbar forholdsændring, som imidlertid blev signifikant forstærket efter SAG-behandling (Fig. 5F og SI Appendix, Fig. S10B). Interessant nok ophævede den glatte receptorantagonist cyclopamin, som kunne forventes at have den modsatte virkning af SAG, ikke 5-HT-stimuleret cAMP-signalering i primære cilier af 3T3-celler (søjlediagram, Fig. 5F).

Med dette system var vi også i stand til at evaluere evnen af en ciliær Gαi-koblet GPCR, SSTR3, til at vende serotoninstimulerede cAMP-signaler i ciliet. Behandling af 3T3-celler, der samudtrykker SSTR3-GFP og 5-HT6-H187 med somatostatin, vendte 5-HT-reaktioner tilbage til baseline inden for 2 min i tilstedeværelse og fravær af SAG-behandling (Fig. 5 G og H), hvilket indikerer lokal kontrol af 5-HT6-funktionen. Vi testede derefter yderligere, hvordan SAG påvirkede aktiviteten af en anden ciliær Gαs-koblet GPCR, dopamin D1R-receptoren (5). D1R-EGFP blev coeksprimeret med 5-HT6-H187 i 3T3-celler, og celler med fluorescens kun i cilia blev udvalgt. Ti nanomolær dopamin producerede små, men målbare cAMP-signaler i kontrolceller (Fig. 5I), og igen blev signalet signifikant forstærket efter SAG-behandling (Fig. 5J; opsummeret i søjlediagrammet).

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.