Free Press

Af G.P. ThomasApr 15 2013

Billedkreditering: khawfangenvi16/.com

Højtydende væskekromatografi eller højtryksvæskekromatografi (HPLC) er en kromatografisk metode, der anvendes til at adskille en blanding af forbindelser i analytisk kemi og biokemi med henblik på at identificere, kvantificere eller rense de enkelte komponenter i blandingen.

HPLC i omvendt fase eller Ultra-high Performance Liquid Chromatography (UHPLC) er en almindeligt anvendt separationsmetode. Den giver dynamisk retention af forbindelser med hydrofobisk og organisk funktionalitet. En kombination af hydrofobiske og van der Waals-lignende interaktioner mellem alle målforbindelser og både den stationære og mobile fase gør det muligt at tilbageholde disse forbindelser ved hjælp af omvendt fase.

Hvordan fungerer HPLC?

I meget små mængder sendes den prøveblanding, der skal adskilles og testes, ind i en strøm af mobil fase, der perkolerer gennem en kolonne. Der findes forskellige typer kolonner med sorbenter af forskellig partikelstørrelse og overflade.

Blandingen bevæger sig gennem kolonnen med varierende hastighed og interagerer med sorbenten, også kendt som den stationære fase. Hastigheden for hver enkelt komponent i blandingen afhænger af 1) dens kemiske art, 2) kolonnens beskaffenhed og 3) sammensætningen af den mobile fase. Det tidspunkt, hvor en bestemt analysand kommer ud af kolonnen, betegnes som dens retentionstid. Retentionstiden måles under specifikke betingelser og betragtes som et identifikationsmærke for en given analysand.

Sorbentpartikler kan være hydrofobiske eller polære af natur. De almindeligt anvendte mobile faser omfatter enhver blandbar kombination af vand og organiske opløsningsmidler som f.eks. acetonitril og methanol. Der kan også anvendes vandfrie mobile faser.

Den vandige komponent i den mobile fase kan indeholde syrer som myresyre, fosforsyre eller trifluoroeddikesyre eller salte for at muliggøre adskillelse af prøvekomponenterne. Sammensætningen af den mobile fase holdes enten konstant eller varieres under den kromatografiske analyse. Den konstante fremgangsmåde er effektiv til adskillelse af prøvekomponenter, der ikke er meget forskellige i deres affinitet for den stationære fase. Ved den varierede metode varierer sammensætningen af den mobile fase fra en lav til en høj elueringsstyrke. Den mobile fases elueringsstyrke afspejles af analysandens retentionstider, hvor høj elueringsstyrke giver hurtig eluering.

Sammensætningen af den mobile fase vælges ud fra intensiteten af interaktionerne mellem flere prøvekomponenter og den stationære fase.

HPLC-partitioneringsprocessen minder meget om væske-væskeekstraktionsprocessen bortset fra, at førstnævnte er en kontinuerlig proces i modsætning til sidstnævnte, som er en trinvis proces. Det anbefales, at der udføres forsøg med partitioneringsprocesser for at bestemme den nøjagtige HPLC-metode, der vil give en passende separation.

Fabrikanter af HPLC-systemer

Der findes i dag et bredt udvalg af HPLC-muligheder på markedet. Følgende er en liste over forskellige producenter af HPLC-systemer med en kort introduktion af deres produkter:

• Dionex, en virksomhed baseret på videnskaben om kromatografi, fremstiller UltiMate® 3000 Rapid Separation LC-systemet, UltiMate 3000 RSLCnano-systemet og Corona®-familien af universelle ladede aerosoldetektorer.
• Jasco Analytical Instruments leverer en række HPLC-systemer. HPLC-systemerne i LC-2000 Plus-serien kan konfigureres på enestående vis. Med høj ydeevne og lave omkostninger kan disse HPLC-systemer tilpasses til stort set alle krav fra simpel isokratisk QA til avanceret metodeudvikling med flere opløsningsmidler/flersøjlemetoder. Det isokratiske LC-2000plus-Iso er forsynet med en pumpe, afgasning, autosampler og UV/Vis-detektor. Pumpen er konstrueret med flowhastigheder fra 1µL til 10mL/min ved tryk på op til 500 bar til brug med 2, 3, 4, 6 og op til 10 mm ID-søjler. Den binære gradient LC-2000plus-HPG svarer til det isokratiske system, men er forsynet med en gradientpumpe med to opløsningsmidler. Pumpens flowhastigheder er kompatible med 1 mm kolonner. Den kvaternære gradient LC-2000plus-LPG svarer også til det isokratiske system; denne model er dog forsynet med en kvaternær gradientpumpekonfiguration for maksimal fleksibilitet med hensyn til opløsningsmidler.
• Det præparative HPLC-system fra Gilson har et bredt flowområde, der kan tilpasses til både semi-præparative og præparative separationer. Dens høje pumpeeffekt giver mulighed for et bredt udvalg af præparative kolonnestørrelser. Systemet er designet med et nyt skyllestationssystem, der omfatter en flydende jetvask og giver mulighed for at anvende op til to forskellige skylleopløsningsmidler.
• Sharp™ HPLC-systemer fra AAPPTec er forsynet med pumper, der er mikroprocessorstyrede og dermed muliggør meget præcise og meget nøjagtige flowhastigheder, hvilket kan bidrage til at opnå fremragende analytisk reproducerbarhed og højeste målingsnøjagtighed.

Andre producenter på det nuværende marked er Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad og Buck Scientific.

Fordele ved HPLC

De vigtigste fordele ved HPLC-systemer er som følger:

• Kontrollerer og automatiserer kromatografiinstrumentering
• Giver datastyring, sikkerhedsfunktioner og rapportering og instrumentvalidering.
• Kraftig og tilpasningsdygtig
• Øger produktiviteten ved at styre alle analyseområder – fra prøve til instrument og fra separation til rapportering af resultater.
• Bar

Anvendelser af HPLC

Hovedformålet med HPLC-teknikken er at identificere, kvantificere og oprense en bestemt analysand eller forbindelse. Der kan foretages både kvantitativ og kvalitativ analyse. HPLC’er kan anvendes til følgende anvendelser:

• Vandrensning
• Detektion af urenheder i medicinalindustrien
• Prekoncentrering af sporstoffer
• Ligandbytningskromatografi
• Ionbytningskromatografi af proteiner
• Høj-pH-anion-udvekslingskromatografi af kulhydrater og oligosaccharider

Kilder og yderligere læsning

• HPLC/UHPLC-kromatografi i omvendt fase-Phenomenex
• Dionex Products-Dionex
• HPLC Systems-aapptec
• Preparative HPLC System-Gilson

Denne artikel blev opdateret den 22. april, 2019.

Skrevet af

G.P. Thomas

Gary er uddannet fra University of Manchester med en førsteklasses æresgrad i geokemi og en mastergrad i geovidenskab. Efter at have arbejdet i den australske mineindustri besluttede Gary at lægge geologistøvlerne på hylden og begynde at skrive. Når han ikke er i gang med at udvikle aktuelt og informativt indhold, kan Gary som regel finde på at spille sin elskede guitar eller se Aston Villa FC snuppe nederlaget fra sejrens gab.

Citationer