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3.1.2 Azide

Azide gelten als eine der am besten geeigneten Gruppen für bioorthogonale Reaktionen und Click-Chemie. Im Gegensatz zu Keton und Aldehyd kommen Azide in biologischen Systemen kaum vor. Azide besitzen eine hohe intrinsische Energie, aber keinen natürlichen Reaktionspartner (King und Wagner, 2014), haben eine geringe Größe und eine neutrale Gesamtladung, und schließlich sind sie unter physiologischen Bedingungen kinetisch stabil.

Die Staudinger-Ligation ist in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt worden. So setzten Raines et al. diese Reaktion als cysteinfreie Alternative zu NCL für die Peptidligierung (Nilsson et al., 2001) und in Kombination mit NCL für den Aufbau künstlicher RNAase A (Nilsson et al., 2005) ein. Darüber hinaus wurde es für andere Anwendungen eingesetzt, wie die Immobilisierung von Proteinen auf festen Trägern für die In-vitro- und In-vivo-Bildgebung (Saxon und Bertozzi, 2000; Prescher et al., 2004), die Markierung von Biomolekülen in vitro und in vivo (Saxon und Bertozzi, 2000; Prescher et al, 2004; Vocadlo et al., 2003), Proteinanreicherung (Vocadlo et al., 2003) und -nachweis (Charron et al., 2009) sowie (Lemieux et al., 2003) Proteinmodifikation.

Dennoch hat die Staudinger-Ligation einige Nachteile. Nämlich ihre langsame Kinetik (Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung im niedrigen 10-3 M-1s-1-Bereich) (Lin et al, 2005), die Oxidationsanfälligkeit der Phosphinverbindungen (es müssen relativ hohe Konzentrationen des Phosphinreagens verwendet werden) und die mögliche Kreuzreaktivität der Phosphine mit Disulfiden (Lang und Chin, 2014; King und Wagner, 2014).

Azide können mit Alkinen in einer Cu(I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) oder 1,3-dipolaren Cycloaddition (Abb. 5.6B) reagieren, einem der gängigsten Beispiele für Click-Chemie-Reaktionen (Rostovtsev et al, 2002; Tornøe et al., 2002). Diese Reaktion ist für die Biowissenschaften von großem Interesse, da sie eine gute Selektivität, eine hohe Ausbeute und milde Reaktionsbedingungen (Raumtemperatur in verschiedenen Lösungsmitteln) aufweist. Außerdem können sowohl Azide als auch Alkine in Proteine eingeführt werden, ohne die Proteinstruktur und -funktion zu beeinträchtigen (Steen Redeker et al., 2013). Das Azid und das Alkin können unter physiologischen Bedingungen in Gegenwart von Cu(I) sehr schnell eine stabile 1,2,3-Triazol-Bindung bilden. Der von Sharpless et al. (Rostovtsev et al., 2002) vorgeschlagene Mechanismus beschreibt zunächst die Einführung des terminalen Alkins in ein Kupferacetylid und einen anschließenden Angriff des Azids (King und Wagner, 2014). Kürzlich wurde dieser Mechanismus weiter verfeinert, und es wurde ein Dikupfer-Zwischenprodukt vorgeschlagen (Worrell et al., 2013). Die größten Nachteile dieser Reaktion sind die Cu(I)-abhängigen Nebenreaktionen und die Cu(I)-Zytotoxizität (Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011), die ihre Anwendung hauptsächlich auf die Markierung im extrazellulären Raum beschränkt haben (King und Wagner, 2014). CuAAC wurde in vielen verschiedenen biologischen Studien eingesetzt, z. B. zur Markierung von Phospholipiden für deren Bildgebung in vivo (Jao et al., 2009) und in vitro (Neef und Schultz, 2009), zum Umbau der Virusoberfläche (Steinmetz et al., 2009), zur Modifizierung/Markierung von Proteinen in vitro und in vivo (Link und Tirrell, 2003; Ngo und Tirrell, 2011; Liu und Schultz, 2010; Deiters et al., 2003), zur Markierung von Nukleinsäuren (Weisbrod und Marx, 2008) und zur Erstellung von Sondenprofilen auf Affinitätsbasis (Speers et al., 2003).

Um die Zytotoxizität von Kupfer zu überwinden, wurden verschiedene Ansätze entwickelt. Dabei handelt es sich um die Verwendung von wasserlöslichen Liganden für die Cu(I)-Koordination, die Verwendung von kupferchelatbildenden organischen Aziden und die Einführung einer Ringspannung in die Alkineinheit. Im ersten Fall koordinieren die wasserlöslichen Liganden Cu(I), um einen aktivierten Kupferkatalysator zu bilden, der in der Lage ist, die CuAAC bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen des Metalls zu fördern und gleichzeitig die potenzielle Toxizität von Cu(I) zu verringern (Besanceney-Webler et al., 2011; Del Amo und Wang, 2010; Hong et al., 2009; Kennedy et al., 2011). Im zweiten Fall wird die effektive Cu(I)-Konzentration an der Reaktionsstelle durch die Verwendung von Azidliganden mit einer internen kupferchelatbildenden Einheit erhöht (Brotherton et al., 2009; Kuang et al., 2010; Uttamapinant et al., 2012). Die letzte Strategie umfasst die Verwendung von Alkinen, die so aktiviert wurden, dass sie in Abwesenheit eines Katalysators mit verbesserter Kinetik reagieren. In diesem Zusammenhang erhöht die Verwendung von Cyclooctin-Komponenten die Reaktivität aufgrund der Freisetzung von Ringspannung (Steen Redeker et al., 2013; Baskin et al., 2007; Plass et al., 2011). Die stammbetriebene Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) (Abb. 5.6C) hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug nicht nur für die Markierung von Proteinen und Antikörpern, sondern auch für andere Anwendungen wie die antikörperfreie Western-Blot-Analyse entwickelt (Boutureira et al., 2015), da keine zusätzlichen Reagenzien oder toxischen Metalle benötigt werden, die Biomoleküle schädigen könnten. So haben Bertozzi et al. die Anwendbarkeit bei der Modifizierung von gereinigten Proteinen nachgewiesen (Baskin et al., 2007). In weiteren Experimenten wurde die Reaktion erfolgreich in vitro auf Fibroblastenzellen angewendet (Baskin et al., 2007). Darüber hinaus wurde SPAAC zur Darstellung von Tumoren in lebenden Mäusen mit Hilfe von Nanopartikeln (Koo et al., 2012) und 18F-PET verwendet, wobei das Fluor sowohl an Azid als auch an Cycloalkin gebunden wurde (Jeon et al., 2012). Weitere Anwendungsgebiete wurden in der Virusmodifikation und der DNA-Markierung gefunden (Qiu et al., 2013). Die komplexe Synthese von Cyclooctinen und die Tatsache, dass ihre erhöhte Sperrigkeit und Hydrophobie die Proteinstruktur und -stabilität beeinträchtigen können (Kim et al., 2013), und dass ihre erhöhte Aktivierung Nebenreaktionen mit natürlich vorkommenden Thiolen begünstigen kann, können als Nachteile angesehen werden.

Elektronenarme Sulfonylazide können auch mit aktivierten Alkenen (Oxanorbornadiene oder Norbornene) in einer metallfreien Cycloaddition (Abb. 5.6D) reagieren, ähnlich der SPAAC (Alder, 1930; Huisgen et al., 1980). Das Produkt der Azid-Alken-Cycloadditionen ist jedoch ein relativ instabiles Triazolin im Gegensatz zu den aromatischen Triazolen, die bei der klassischen Click-Cycloaddition entstehen. Ein Oxanorbornadien, das sowohl angespannt als auch elektronenarm ist, wurde als Dipolarophil in einer Reaktion mit Aziden verwendet (van Berkel et al., 2008). In diesem Fall reagiert die gespannte Doppelbindung in Oxanorbornadien mit Aziden unter Bildung eines intermediären Triazolins, das spontan eine Retro-Diels-Alder-Reaktion unter Freisetzung von Furan durchläuft, was zu stabilen 1,2,3- oder 1,4,5-Triazolen führt. Diese Reaktion wurde zur selektiven Biokonjugation eines Oxanorbornadien-funktionalisierten Proteins und eines Azid-modifizierten zyklischen Peptids in wässrigen Puffern genutzt. Obwohl Oxanorbornadiene einfacher zu synthetisieren sind als ihre Cyclooctin-Gegenstücke, ist diese Cycloaddition-Reaktion recht langsam und nicht vollständig chemoselektiv in Bezug auf andere funktionelle Gruppen in Proteinen, was ihre breite Anwendung eingeschränkt haben könnte (Lang und Chin, 2014; van Berkel et al., 2008).