1 EINLEITUNG
Phospholipid-Doppelschichtmembranen (BLMs) stellen ein nützliches Modellsystem dar, um grundlegende Aspekte der Lipid-Doppelschicht-Komponenten biologischer Zellmembranen zu untersuchen und insbesondere ihre elastischen Eigenschaften zu erforschen. Sie sind selbstorganisierte Strukturen aus amphipatischen Molekülen mit physikalischen Eigenschaften, die denen von smektischen Flüssigkristallen sehr ähnlich sind. In die Lipid-Doppelschichtmatrix können sowohl hydrophobe als auch amphipatische Moleküle wie Proteine, andere Lipide, Peptide, Steroide und Cosurfactants eingebaut werden. Die elastischen Eigenschaften von Lipidmembranen, die als kontinuierliche Medien betrachtet werden, wurden für eine Vielzahl von Studien genutzt, die von lokalen Phänomenen wie Lipid-Lipid-, Lipid-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen bis hin zu Formschwankungen der gesamten Zelle reichen. Darüber hinaus wird der flüssige Kohlenwasserstoffcharakter der Doppelschicht durch intermolekulare Wechselwirkungen zwischen den Phospholipiden auf nanoskopischer Ebene aufrechterhalten: elektrostatische und Dipol-Dipol-Wechselwirkungen zwischen den polaren Kopfgruppen, Wechselwirkungen, die durch Wassermoleküle vermittelt werden, und Van-der-Waals-Dispersionswechselwirkungen zwischen den Kohlenwasserstoffketten.
Die Oberflächen eines BLM sind weder vollkommen planar noch starr. Das BLM-System ist eine quasi-zweidimensionale flexible Struktur, die kontinuierlich eine Vielzahl von Konformations- und dynamischen Übergängen durchläuft. Außerdem sind die künstlichen und natürlichen BLMs keine isolierenden Systeme, sondern durchlässig für Wasser und Elektrolyte, die durch eine Vielzahl von Transmembranporen diffundieren.
Stochastische Transmembranporen werden durch einen der folgenden Mechanismen erzeugt: zufällige und einseitige thermische Fluktuationen (Thermoporation) und elektrische Auslösung (Elektroporation). Lipidmoleküle in BLM folgen drei verschiedenen Kategorien zufälliger thermischer Bewegungen: laterale Translationen, parallel zur Oberfläche der Doppelschicht, mit einem lateralen Diffusionskoeffizienten in der Größenordnung von 10-7 m2s-1 (Dl), Oszillationen und Rotationen um die Lipidachsen senkrecht zur Oberfläche der Doppelschicht.
Laterale Translationen mit zufälligen Richtungen induzieren lokale Fluktuationen der Dichte der polaren Lipid-Kopfgruppen an den Oberflächen der Doppelschicht. Daher zeigt eine Momentaufnahme der Doppelschichtoberfläche lokale Domänen von nanoskopischer Größe mit einer höheren Dichte polarer Kopfgruppen (d.h. Cluster) sowie Zonen mit einer geringeren Dichte. Unter bestimmten physikalischen Bedingungen der BLM (pH-Wert, Temperatur, Lipidkomponenten, elektrochemisches Potenzial usw.) stellen die letztgenannten Zonen kleine lokale Defekte (d. h. Leerstellen) der Membran dar. In diesen Bereichen können die Wassermoleküle die hydrophobe Matrix der Doppelschicht durchdringen. Betrachten wir den Fall zweier unabhängiger Defekte aus jeder Monoschicht, die in einer senkrechten Richtung auf der Membranoberfläche ausgerichtet sind. Sie können eine zylindrische hydrophobe Pore bilden, deren Innenfläche von den hydrophoben Ketten der Lipide flankiert wird. Daher sind diese Arten von transienten Poren hydrophober Natur. Es ist auch möglich, dass die polaren Kopfgruppen, die sich in der Nähe einer hydrophoben Pore befinden, Rotationen in Richtung ihres Inneren gehorchen. In diesem Fall wird die innere hydrophobe Oberfläche der Poren mit polaren Kopfgruppen beschichtet. Diese Poren sind also hydrophil, haben keine zylindrische Geometrie mehr und sind stabiler als die hydrophoben Poren. Mit anderen Worten, die zufälligen thermischen Fluktuationen der Dichte der polaren Kopfgruppen in den beiden Monoschichten des BLM sind in der Lage, stochastische Transmembranporen zu erzeugen.
Das Vorhandensein von hydrophoben Dickenfluktuationen im BLM wurde sowohl theoretisch als auch experimentell nachgewiesen. Dies wurde durch die Bestimmung der Werte der Doppelschichtdicke (h) mit drei unabhängigen Verfahren erreicht: elektrische Kapazitätsmessungen (hc) , optische Reflexionsmessungen (hr) und direkte Berechnung (hav). Tanford (1980) berechnete die Dicke der Doppelschicht anhand der folgenden Formel hav = Nl M/ρ, wobei Nl, M und ρ die Anzahl der Lipide pro Flächeneinheit, das Molekulargewicht der hydrophoben Ketten bzw. die Dichte der hydrophoben Zone sind. Wegen der „Dickenschwankungen“ der hydrophoben Bereiche sollte hc gleich hav sein, während in diesem Fall beide um die Dicke der polaren Schicht (htp) kleiner als hr sein sollten: hc ≅ hav = hr-htp. Wenn die Lipiddoppelschicht eine einheitliche Dicke hätte, dann müsste hc gleich hav sein. Bei BLM, die aus einer binären Lipidmischung bestehen, kommt es nach dem Auftreten von Phospholipiddomänen zu einer selektiven Assoziation zwischen den Phospholipiden. Ihre Dicke hängt von der Länge der Kohlenwasserstoffkette der Lipidkomponenten ab. Popescu et al. (1991) wiesen das Auftreten stochastischer Poren in BLMs aufgrund von Fluktuationen in der Dicke der Doppelschicht nach. Die Höhe der Energiebarriere für die Perforation der Membran infolge eines solchen Mechanismus ist jedoch groß (etwa 91 kT, wobei k und T die Boltzmann-Konstante bzw. die absolute Temperatur sind). In diesem Fall hat das geometrische Profil der Pore eine elliptische, toroidale Form. Es wurde auch gezeigt, dass sich eine solche Transmembranpore zu einem stabilen Zustand entwickeln kann. Die mit diesem Modell erzielten Ergebnisse waren aufgrund der schnellen Zeitskala für das Schließen statistischer Poren in Membranen recht überraschend. Zwei Jahre später haben Zhelev und Needham (1993) große, quasistabile Poren in Lipid-Doppelschicht-Vesikeln erzeugt und damit die Vorhersage des früheren Modells bestätigt. Moroz und Nelson (1997) berechneten den Bruchwiderstand der Membran in Form einer Linienspannung für eine große Pore in Doppelschichtvesikeln.
Stochastische Transmembranporen können auch durch einseitige thermische Bewegung von Lipiden gebildet werden. Dieser Mechanismus wird manchmal als Thermoporation bezeichnet. Die Poren entstehen in der Membran durch einen thermisch induzierten Aktivierungsprozess. Alternativ kann der Aktivierungsprozess für die Porenbildung auch durch ein äußeres elektrisches Feld ausgelöst werden (auch Elektroporation genannt). Die durch Elektroporation erzeugte Pore ist größer und stabiler. Der Mechanismus der Elektroporation wurde für die Verabreichung von Medikamenten und Genen an Zellen und Gewebe vorgeschlagen.
Transmembranproteinporen werden von proteinhaltigen Systemen gebildet, die ein breites Spektrum von kleinen Peptidkanälen (z. B. Gramicidin, Alamethicin, Melittin usw.) bis hin zu großen multimeren Proteinkanälen abdecken. Da diese Poren groß und wassergefüllt sind, können hydrophile Substanzen, einschließlich Ionen, durch sie hindurch diffundieren, wodurch das elektrische Potenzial der Membran abgeleitet wird. Transmembranproteinporen bestehen aus integralen Proteinen aus zwei Hauptstrukturklassen: (1) selektive Kanäle, die von gebündelten transmembranen a-helicalen Strukturen gebildet werden, und (2) selektive Kanäle, Poren und Porine, die von monomeren (z.B. OmpG), dimeren (z.B. selektive Cl-Kanäle), trimeren (z.B. OmpF) oder multimeren transmembranen ß-Fass-Strukturen (z.B. α-Hämolysin, Leukozidine, Cytolysine) gebildet werden. Die Lipiddoppelschicht kann als In-vitro-System zur Untersuchung dieser Proteinkanäle verwendet werden, wenn sie zu einer funktionellen Membran rekonstituiert werden. Darüber hinaus können die BLMs als Werkzeug für das Membranprotein-Engineering und seine Anwendungen in der Einzelmolekül-Biophysik oder im biotechnologischen Bereich verwendet werden.
In einem anderen Beispiel bildet Colicin Ia, ein von Escherichia coli sezerniertes Protein, spannungsgesteuerte Ionenkanäle sowohl in der inneren Membran von Zielbakterien als auch in planaren BLMs. Colicin Ia ist ein Membrantransporter, der zur Klasse der Bakterientoxine gehört, die dieselbe Strategie verfolgen: Sie werden in die Membran der anderen, mit Nährstoffen konkurrierenden Bakterien eingeschleust, wodurch große Poren entstehen. Diese Poren beschädigen das elektrochemische Membranpotenzial und führen schließlich zum Tod dieser konkurrierenden Bakterien. Im Vergleich zu den oben erwähnten stochastischen Poren haben die proteinhaltigen Poren einen anderen Bildungsmechanismus und auch andere Eigenschaften. Während eine stochastische Pore ihren Entstehungsmechanismus „vergisst“, scheinen einige der transmembranen Proteinporen (z.B. Colicin Ia) „Gedächtniseffekte“ aufzuweisen, zumindest unter dem Einfluss einer bestimmten Impulsfolge, die für die elektrische Stimulation der BLM verwendet wird.
Genetische Poren wurden in der Wand von Sinusoidgefäßen der Säugetierleber gefunden. Die Endothelzellen dieser Gefäße weisen zahlreiche Siebplattenporen auf. Diese Poren mit einem Durchmesser von etwa 0,1 μm ermöglichen es einem Teil des Blutplasmas und der Chylomikronen, vom sinusoidalen Raum in den Raum der Disse zu gelangen. Daher steuern die Endothelporen den Austausch von Flüssigkeiten, gelösten Stoffen und Partikeln zwischen dem sinusoidalen Blut und dem Raum der Disse.
In dieser Arbeit haben wir die Elastizitätstheorie kontinuierlicher Medien verwendet, um das Auftreten stochastischer Poren in planaren BLMs zu beschreiben.