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Einführung

Um die Weltbevölkerung, die bis zum Jahr 2050 voraussichtlich 9 Milliarden Menschen erreichen wird (http://www.unpopulation.org), ausreichend mit Nahrungsmitteln zu versorgen, müssen die Reiserträge um mindestens 60 % steigen (FAO 2009). Reis ist das Grundnahrungsmittel für mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung, und diese Reis konsumierende Bevölkerung wächst jährlich um 1,098 % (http://esa.un.org/wpp/Excel-Data/population.htm). Eine wachsende Bevölkerung bedeutet eine steigende Nachfrage nach Nahrungsmitteln, Wasser und Land in einer Zeit, in der die natürlichen Ressourcen für die Landwirtschaft schwinden, weil große Flächen von der Nahrungsmittelproduktion zur Industrialisierung und Biokraftstoffproduktion umgewidmet werden. Der unvorhersehbare Klimawandel droht, die landwirtschaftlich nutzbaren Flächen durch mehr Dürren und Überschwemmungen weiter zu verringern (http://www.fao.org/docrep/017/aq191e/aq191e.pdf). Da die wachsende Bevölkerung und der globale Klimawandel die Nahrungsmittelversorgung der Welt zunehmend unter Druck setzen, ist es von entscheidender Bedeutung, dass wir die Leistung der Kulturpflanzen in Bezug auf die Getreideproduktivität weiter verbessern, um mit dem Bevölkerungswachstum Schritt zu halten. Die Steigerung der Pflanzenproduktivität durch die in der Zeit der grünen Revolution geschaffenen Pflanzentypen hat den Bevölkerungsboom nach den beiden Weltkriegen unterstützt. Seitdem hat sich das Ertragspotenzial der heutigen Reissorten trotz der Verwendung verbesserter Sorten und fortschrittlicher Technologien nur wenig verbessert, was darauf hindeutet, dass diese Sorten an eine Ertragsgrenze gestoßen sind (Akita 1994). Kürzlich wurde ein Versuch unternommen, das Ertragspotenzial von Reis durch die Entwicklung einer effizienten C4-Photosynthese in Reis zu erhöhen (Kajala et al. 2011). Dazu müssen eine Reihe von Genen, die die Blattanatomie und biochemische Prozesse regulieren, in den Reis eingebracht und in geeigneter Weise exprimiert werden, was derzeit mit herkömmlichen Pflanzenzüchtungstechniken allein nicht möglich ist. Daher würde die Gentechnik zur Verbesserung des Photosynthesewegs von Reis eine ausreichende Möglichkeit bieten, die tatsächliche Kornproduktivität und das Ertragspotenzial zu steigern. Die Gentechnik stellt ein effizientes und präzises Züchtungsinstrument dar, bei dem nur die interessierenden Gene eingeführt werden können, selbst wenn sie von entfernt verwandten Arten stammen.

In C3-Pflanzen wie Reis wird CO2 durch das photosynthetische Enzym Ribulose-1,5-Bisphosphatcarboxylase-Oxygenase (Rubisco) in eine 3-Kohlenstoff-Verbindung assimiliert. Wie der Name schon sagt, katalysiert Rubisco auch die Oxidation von Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP) in einem verschwenderischen Prozess, der als Photorespiration bekannt ist und zu einem Verlust von bis zu 25 % des zuvor gebundenen Kohlenstoffs führen kann (Sage 2004). Bei Temperaturen über 30°C, wie sie für die tropischen Reisanbaugebiete der Welt typisch sind, nimmt die Sauerstoffanreicherung erheblich zu, was die photosynthetische Effizienz von C3-Pflanzen um bis zu 40% verringert (Ehleringer und Monson 1993). Dadurch wird die Photosynthese von Reis in den Tropen und in warm-gemäßigten Regionen ineffizient. C4-Pflanzen, die über einen Mechanismus zur CO2-Konzentration in ihren Blättern verfügen, haben eine sehr viel geringere Photorespiration und haben sich daher so entwickelt, dass sie in heißen, trockenen Umgebungen gedeihen und wertvolle Erkenntnisse für Strategien zur Verbesserung von Kulturpflanzen bieten. Reis mit einem C4-Photosynthesemechanismus würde eine höhere photosynthetische Effizienz aufweisen und gleichzeitig knappe Ressourcen wie Land, Wasser und Dünger, insbesondere Stickstoff, effektiver nutzen (Hibberd et al. 2008). Da er auch bei hohen Temperaturen leistungsfähig ist und weniger Wasser und Stickstoff benötigt, würde C4-Reis verschiedenen Arten von Reisökosystemen, einschließlich der Grenzertragsflächen, zugute kommen.

Die C4-Photosynthese ist einer der drei biochemischen Mechanismen, die von Pflanzen zur Bindung von CO2 in der Atmosphäre eingesetzt werden, die anderen sind der C3- und der Crassulaceen-Säurestoffwechsel (CAM). Die C4-Photosynthese hat sich mehr als 66 Mal unabhängig voneinander entwickelt (Sage et al. 2012), zumindest in 19 Familien während der Evolution der Angiospermen aus C3-Vorfahren (Muhaidat et al. 2007), und sie bringt Veränderungen der zellulären Strukturen, der Biochemie und damit der Entwicklung der Blätter mit sich. Diese hochspezialisierte Form der Photosynthese hat im Wesentlichen einen CO2-Konzentrationsmechanismus um das Rubisco-Enzym herum entwickelt, wodurch die Oxygenase-Funktion von Rubisco entfällt und die Energieverschwendung durch die Photorespiration verringert wird (Douce und Heldt 2000). Rubisco aus C4-Arten ist in Bezug auf die Carboxylierung effizienter als aus C3-Arten (Kubien et al. 2008). Zu den weiteren Vorteilen des C4-Systems gehören eine höhere Wassernutzungseffizienz, da durch teilweise geschlossene Spaltöffnungen ein steilerer Konzentrationsgradient für die CO2-Diffusion aufrechterhalten werden kann, eine höhere Strahlungsnutzungseffizienz, da die C4-Photosyntheseeffizienz bei hoher Lichtintensität nicht in die Sättigung gerät (Rizal et al. 2012), und eine höhere Stickstoffnutzungseffizienz, da weniger Rubisco und damit weniger Stickstoff benötigt wird.

C4-Pflanzen sind bei höheren Temperaturen, wie sie typischerweise bei Reis auftreten, potenziell produktiver. Um die Vorteile dieses effizienteren Photosynthesesystems in einer Zeit zu nutzen, in der die Bevölkerung und die Lebensmittelpreise in die Höhe schnellen, gibt es Bestrebungen, den C4-Mechanismus, wie er in Mais vorkommt, in Reis einzubauen (Rizal et al. 2012). Dieser neuartige Ansatz zur Veränderung des Photosynthesesystems von Reis ist ein schwieriges und langfristiges Unterfangen, da der C4-Weg sehr komplex ist und viele Faktoren, die den Mechanismus steuern, noch unbekannt sind. Daher erfordert es den Einfallsreichtum und das Fachwissen von Wissenschaftlern aus verschiedenen Disziplinen wie Gentechnik, Biochemie, Bioinformatik, Molekularbiologie, Photosynthese, Systembiologie, Physiologie, Pflanzenzucht, Metabolomik usw. Zu diesem Zweck wurde das C4-Reiskonsortium konzipiert und gegründet, das 2009 mit der praktischen Arbeit der C4-Reistechnik begann (http://photosynthome.irri.org/C4rice/). Diese Übersicht gibt einen aktuellen Überblick über die Voraussetzungen für die Entwicklung von C4-Reis und die Fortschritte auf dem Gebiet der Gentechnik. Basierend auf der Untersuchung der Evolution von C4 aus C3-Arten und den damit verbundenen Veränderungen sind die folgenden Modifikationen wesentlich, um einen funktionalen C4-Photosyntheseweg in Reis zu etablieren.

Erhöhung der Anzahl und Größe der Chloroplasten in den Bündelscheidenzellen von Reis

In Reis befinden sich mehr als 90 % der gesamten Chloroplasten in den Mesophyllzellen (MCs) innerhalb des Blattes (Yoshimura et al. 2004), während in C4-Pflanzen sowohl MCs als auch Bündelscheidenzellen (BSCs) die gleiche Anzahl an Chloroplasten besitzen (Abbildung 1A und B). Dies liegt daran, dass bei C3-Pflanzen der gesamte Prozess der Photosynthese in den MC stattfindet, während bei C4-Pflanzen der Prozess der Photosynthese in MC und BSC aufgeteilt ist. Die MCs führen die erste CO2-Fixierung durch, bei der eine 4-Kohlenstoff-Verbindung namens Oxalacetat gebildet wird, die in C4-Säuren wie Malat umgewandelt wird, die in die BSCs transportiert werden und so eine effiziente Assimilation von CO2 in Kohlenhydrate durch den Calvin-Zyklus in den BSCs ermöglichen. Anders als bei C3-Pflanzen haben die BSCs von C4-Pflanzen also photosynthetische Funktionen wie die Decarboxylierung der C4-Verbindung und den Prozess des Calvin-Zyklus. Um diese Prozesse durchzuführen, sind die BSCs in C4-Pflanzen vergrößert und haben mehr Chloroplasten, wodurch die BSCs ausgeprägter und photosynthetisch aktiv sind. Die BSCs von C3-Arten haben die Aufgabe, den hydraulischen Druck auszugleichen, das Eindringen von Luft aus den Interzellularräumen in das Xylem zu verhindern, ein Wasserreservoir zur Pufferung von Transpirationsverlusten bereitzustellen und den Eintritt und die Streuung von Licht höherer Intensität, das auf die Adern trifft, in das Blatt zu ermöglichen (Nikolopoulos et al. 2002). Zu den weiteren Funktionen der BSCs von C3-Pflanzen gehören der Transport von Stickstoff, Schwefel und Kohlenhydraten sowie die Rolle in den Signalwegen, die in (Leegood 2008) ausführlich beschrieben wurde. Bei C4-Pflanzen arbeiten BSCs und MCs in einer zweistufigen Version der Photosynthese zusammen. Um einen direkten Kontakt zwischen BSCs und MCs zu gewährleisten, besitzen C4-Pflanzen eine besondere Blattanatomie, die mit einer Vermehrung der Chloroplasten in den BSCs einhergeht. Um den C4-Stoffwechselweg in Reis einzuführen, sind mehr photosynthetische Chloroplasten in den BSCs erforderlich, als der Reis jetzt hat. Dies könnte durch Überexpression der genetischen Elemente geschehen, die für die Chloroplastenentwicklung notwendig sind, wie z.B. Golden2-ähnliche (GLK) Gene, und zwar auf zellspezifische Weise unter Verwendung von C4-Genpromotoren, wie z.B. Phosphoenol-Pyruvat-Carboxylase (PEPC) von Zea mays für MC-spezifische Expression und Phosphoenol-Pyruvat-Carboxykinase (PCK)-Promotor von Zoysia japonica für BSC-spezifische Expression in Reisblättern (Matsuoka et al. 1994; Nomura et al. 2005).

Golden2-ähnliche (GLK) Genfamilienmitglieder kodieren nukleare Transkriptionsfaktoren, die die Chloroplastenentwicklung in Arabidopsis, Zea mays und dem Moos Physcomitrella patens regulieren (Rossini et al. 2001). In jeder dieser Arten existieren die GLK-Gene als homologes Paar mit den Namen GLK1 und GLK2 (Waters et al. 2009). In Moos und Arabidopsis sind die GLK-Gene redundant und funktionell äquivalent, während in Mais und Sorghum GLK-Gene zelltypspezifisch die Entwicklung dimorpher Chloroplasten steuern (Waters et al. 2008; Wang et al. 2013a). In Mais akkumulieren die Transkripte von Golden2 (G2) und seinem Homologen ZmGLK1 vor allem in BS- bzw. M-Zellen, was auf eine spezifische Rolle jedes Gens bei der Regulierung der dimorphen Chloroplastendifferenzierung hindeutet (Wang et al. 2013a).

Verringerung des Aderabstands und dadurch Erhöhung der Aderdichte im Blatt

In C3-Arten findet die Photosynthese in den MCs statt. Eine hohe Anzahl von MCs zwischen den aufeinanderfolgenden Adern (Abbildung 1A) drängt die Adern weit voneinander weg, wodurch der Aderabstand erhöht oder die Aderdichte verringert wird. In Reisblättern gibt es weniger als 6 Adern pro mm (Abbildung 2A), Setaria viridis und Sorghum (beides typische C4-Arten) haben mehr als 7 Adern pro mm (Abbildung 2B und C). C4-Blätter haben im Durchschnitt 2 MCs zwischen den Adern (Abbildung 1B). Die höhere Venendichte in den Blättern von C4-Pflanzen führt dazu, dass das Volumen von M- und BS-Gewebe fast eins zu eins übereinstimmt. Die innere Anatomie eines C4-Blattes besteht häufig aus einem sich wiederholenden Muster von Ader-BS-M-M-BS-Ader. BSCs, die von MCs umgeben sind, bilden eine kranzartige Struktur; diese Art der Blattanatomie wurde von dem deutschen Botaniker G. Haberlandt als Kranz-Anatomie“ bezeichnet. C4-BSCs haben ein dichtes Zytoplasma und sind mit einer großen Anzahl von Chloroplasten gefüllt (Abbildung 1B). Für das effiziente Funktionieren des C4-Stoffwechsels ist ein enger Kontakt zwischen M- und BS-Zellen unabdingbar, und diese sind durch eine große Anzahl von Plasmodesmata eng miteinander verbunden (Dengler und Nelson 1999). Die Kranz-Anatomie findet sich mit geringen Abweichungen bei fast allen ein- und zweikeimblättrigen Pflanzenlinien, die den Zweizellenmodus des C4-Photosynthesewegs nutzen. Studien zur Blattanatomie und -morphologie haben mehrere Gene ans Licht gebracht, die für das Wachstum, die Entwicklung oder die Verformung von Zellen in Blättern verantwortlich sind. Ein Gen, ACAULIS1, war für die Verlängerung der Blattzellen verantwortlich (Tsukaya et al. 1993). Die Mutation des Gens CURLEY LEAF (CLF) führte zu eingerollten Blättern in Arabidopsis (Kim et al. 1998). Das Gen Rotunda 1 (RON1) verursachte eine Zunahme der freien Aderenden, ein offenes Venenmuster und eine abgerundete Blattstruktur (Robles et al. 2010). Die Mutation des Scarecrow-Gens in Mais zeigte eine Zunahme der Anzahl der BSCs, eine ungewöhnliche Differenzierung der BS-Chloroplasten, eine Abnahme der Nebenadern und eine Veränderung der Venendichte (Slewinski et al. 2012). Diese Studien, die sich auf die durch Mutation bestimmter Gene hervorgerufene abnormale Venenmusterung beziehen, geben Aufschluss darüber, wie die Kranz-Anatomie reguliert wird, und lassen vermuten, dass mehrere Wege an der Entwicklung des Kranz-Musters beteiligt sind. Das SCARECROW/SHORTROOT-Regulationsnetzwerk wurde als eine der wichtigen Komponenten bestimmt, die für die Musterung der Kranz-Anatomie erforderlich sind, da die Blätter von C3-Pflanzen mit mutiertem Scarecrow-Gen normal waren, während bei C4-Pflanzen die Mutation desselben Gens die Kranz-Anatomie beschädigte (Slewinski et al. 2012; Wang et al. 2013b). Kürzlich wurde gezeigt, dass die Einführung von Maischromosomen in Hafer zu einer Vergrößerung der BSC und einer Verringerung der Aderabstände in C3-Haferblättern führen kann, was zeigt, dass die Anatomie von C3-Blättern verändert werden kann (Tolley et al. 2012). Darüber hinaus wurden große Anstrengungen unternommen, um Sorghum (C4)-Mutanten mit erhöhtem Venenabstand und Reis (C3)-Mutanten mit reduziertem Venenabstand zu screenen, so dass die Gene, die das Merkmal des Venenabstands kontrollieren, identifiziert werden können (Rizal et al. 2012).

Die Aktivität des Calvin-Zyklus sollte in MC deutlich reduziert und in der BSC von Reis stark erhöht sein

Die C4-Photosynthese ist durch einen biochemischen CO2-Pumpmechanismus gekennzeichnet, der die CO2-Konzentration am Ort der Rubisco erhöht. Ein hoher CO2-Gehalt in der Umgebung von Rubisco reduziert die Photorespirationsrate und erhöht die Netto-CO2-Assimilation, was zu einer hocheffizienten Photosynthese führt Weber und von (Caemmerer 2010). Um dies zu erreichen, ist die CO2-Assimilation in C4 auf zwei Zelltypen, die MCs und BSCs, verteilt (Abbildung 3). Daher hängt die C4-Kohlenstofffixierung von der zellspezifischen Genexpression und -lokalisation ab. Die benachbarten photosynthetisch aktiven BS- und M-Zellen interagieren, um die Rubisco-katalysierte O2-Fixierung auszuschalten. In zweizelligen C4-Pflanzen wird CO2 zunächst durch eine O2-unempfindliche Carboxylase, die Phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC, EC 4.1.1.31), in die C4-Säure Oxalacetat in den M-Zellen fixiert. Das Oxalacetat wird dann in Malat oder Aspartat umgewandelt und zu den BSCs transportiert, wo es decarboxyliert und das CO2 freigesetzt wird. Dieses CO2 wird von Rubisco wieder gebunden, und alle nachfolgenden Aktivitäten des Calvin-Zyklus finden in den Chloroplasten der BSCs statt (Nelson und Langdale 1989). Um einen funktionierenden C4-Reis zu erzeugen, muss die Rubisco-Aktivität in den MCs stark reduziert und in den BSCs erhöht werden, wodurch der Calvin-Zyklus auf die BSCs des Reises beschränkt wird, wie in einem C4-System. Andererseits müssen bestimmte Gene, die für die C4-Enzyme wie β-Carbonsäureanhydrase (CA) und PEPC kodieren, im Cytosol der MCs von Reis überexprimiert werden, um die primäre CO2-Fixierung zu erleichtern, so dass CO2 konzentriert und an Rubisco in den BSCs geliefert werden kann. Der C4-Zyklus beinhaltet auch einen umfangreichen Transport von Metaboliten durch die Chloroplastenmembran und das Plasmalemma von MC und BSC (Abbildung 3). Zusätzlich zu den C4-Kernenzymen CA, PEPC, Pyruvat-Orthophosphat (Pi)-Dikinase (PPDK, EC 2.7.9.1), NADP-abhängige Malat-Dehydrogenase (NADP-MDH, EC 1.1.1.82) und NADP-abhängiges Apfelsäure-Enzym (NADP-ME, EC 1.1.1.40), erfordert der C4-Weg auch die Einfügung von Metaboliten-Transportern für Oxalacetat, Malat, Triosephosphat und Pyruvat in Reis, um eine erhöhte Transportkapazität für die C4-Zyklus-Zwischenprodukte bereitzustellen, damit der Calvin-Zyklus in den BSCs effektiv funktionieren kann (Weber und von Caemmerer 2010).

Die Photorespiration in den Mesophyllzellen muss stark reduziert werden

In C3-Pflanzen finden Kohlenstofffixierung und Calvin-Zyklus in den MCs statt. Während der Kohlenstofffixierung reagiert Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) – eine Verbindung mit fünf Kohlenstoffatomen, die durch das Enzym Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase-Oxygenase (Rubisco, EC.4.1.1.39) katalysiert wird – mit CO2, um zwei Moleküle einer 3-Kohlenstoff-Verbindung zu bilden, die 3-Phosphoglycerat (3-PGA) genannt wird. Im Rahmen des Calvin-Zyklus bilden die beiden PGA-Moleküle ein energiereiches Zuckermolekül (Triosephosphat) und regenerieren RuBP für den nächsten Zyklus. Bei den derzeitigen atmosphärischen CO2-Konzentrationen (ca. 400 ppm) katalysiert Rubisco auch eine Reaktion zwischen RuBP und O2, wobei jeweils ein Molekül 2-Phosphoglykolat und 3-PGA entsteht (Peterhansel und Maurino 2011). Das 2-Phosphoglykolat muss durch die so genannte Photorespiration wieder in 3-PGA umgewandelt werden, was eine Reihe von biochemischen Reaktionen beinhaltet. Während dieses Prozesses kommt es zu einem Verlust von zuvor fixiertem Kohlenstoff und Stickstoff, und es muss auch zusätzliche Energie verbraucht werden (Sharpe und Offermann 2013).

C4-Pflanzen haben Mechanismen entwickelt, um die Lokalisierung und die Aktivitäten von Rubisco in BSCs zu beschränken. MCs verhindern räumlich den Kontakt zwischen Rubisco in BSCs und O2 in den Interzellularräumen und verhindern so den Energieverlust durch Photorespiration. Die Eliminierung der Photorespiration durch C4-Pflanzen wird durch ihren sehr niedrigen CO2-Kompensationspunkt, der fast bei Null liegt, und ihre konstant hohe Carboxylierungseffizienz (CE) belegt, ohne dass sie auf Änderungen der O2-Konzentration reagieren (Abbildung 4). Im Gegensatz dazu sank bei C3-Pflanzen der Kompensationspunkt bei einer Änderung der O2-Konzentration von 21 % auf 2 % deutlich von 55 auf 30 ppm (Tabelle 1). In Abbildung 4 wurde die CE gemäß (Li et al. 2009) berechnet, was zeigte, dass sich die CE von Sorghum nicht signifikant mit der Änderung des O2-Gehalts änderte, aber bei Reis gab es eine hoch signifikante Verbesserung der CE, als der O2-Gehalt von 21 auf 2 % gesenkt wurde (Abbildung 4 und Tabelle 1). Die Zunahme der CE in Sorghum betrug nur 6,1 %, während sie in Reis 41,5 % betrug, als die interzelluläre O2-Konzentration auf 2 % gesenkt wurde (Tabelle 1). Diese Daten zeigen, dass es ein großes Potenzial gibt, die photosynthetische Kapazität von Reis durch eine Verringerung der Photorespiration zu erhöhen, was wiederum den Ertrag erheblich steigern würde. Eine Möglichkeit, die Photorespiration in MC zu verringern, besteht darin, das Glycin-Decarboxylase (GDC)-Protein in MC zu reduzieren und seine Akkumulation in BSC einzuschränken, so dass die Decarboxylierung von Glycin ausschließlich in BSC stattfindet, wodurch in BSC eine höhere CO2-Konzentration erzeugt wird, ähnlich wie in C3-C4-Zwischenprodukten (Monson und Rawsthorne 2000). Das C4-Reiskonsortium testet diesen Ansatz mit Hilfe einer künstlichen microRNA, die gegen die GDC-H-Untereinheit von Reis entwickelt wurde und durch den ZmPEPC-Promotor gesteuert wird (Kajala et al. 2011). Ein solcher biochemischer Mechanismus erfordert eine zelluläre Spezialisierung der BSCs, die eine Zunahme der Anzahl der Chloroplasten und Mitochondrien einschließt, wodurch der Organellengehalt der Reis-BSCs angereichert wird, um bei der Rückgewinnung des durch die Decarboxylierung von Glycin durch GDC freigesetzten CO2 zu helfen (Ueno 2011). Ein weiterer erfolgreicher Ansatz, um das durch die Photorespiration freigesetzte CO2 an den Ort der Photosynthese zurückzuholen, ist die Übertragung des Glykolatabbaus von Escherichia coli auf Chloroplasten von Arabidopsis thaliana, bei der Glykolat im Chloroplasten direkt in Glycerat umgewandelt wurde (Kebeish et al. 2007). Diese Strategie, die die Photorespiration reduzierte und die Photosynthese in Arabidopsis verbesserte, beinhaltete eine schrittweise Kerntransformation mit fünf bakteriellen Genen, die für Glykolat-Dehydrogenase, Glyoxylat-Carboligase und Tartronsemialdehyd-Reduktase kodieren, und könnte auch auf andere C3-Pflanzen wie Reis angewandt werden, wobei jedoch die Verwendung bakterieller Gene bei der Züchtung von C4-Reis möglicherweise nicht bevorzugt wird.

Engineering des C4-Wegs in Reis

Es wurde angenommen, dass ein einzelliges C4-System schneller in C3-Pflanzen installiert werden könnte. Es gibt auch Versuche, ein einzelliges C4-Photosynthesesystem in Reis zu entwickeln (Miyao et al. 2011). Zur Einführung eines einzelligen C4-ähnlichen Weges, bei dem MC CO2 einfängt und freisetzt, wie es in Hydrilla verticillata (L.f) Royle. geschieht, wurden vier Enzyme (PEPC, PPDK, NADP-MDH und NADP-ME), die an diesem Weg beteiligt sind, in den transgenen Reisblättern überproduziert (Ku et al. 1999; Fukayama et al. 2001; Tsuchida et al. 2001; Taniguchi et al. 2008). Einige der Hauptprobleme, die für einen einzelligen C4-ähnlichen Stoffwechselweg in Reis gelöst werden müssen, sind: der Mechanismus zur Erleichterung des Transports von PEP durch die Chloroplastenhülle, der Import von OAA in die Chloroplasten und die Richtung der NADP-ME-Reaktion, die Beteiligung von NADP-MDH, das Vorhandensein von endogenem PEPC innerhalb des MC-Chloroplasten von Reis und die weitere Erhöhung der NADP-MDH-Aktivität (Miyao et al. 2011). Terrestrische einzellige C4-Arten wie Bienertia cycloptera, B. sinuspersici und Suaeda aralocaspica, die zur Familie der Chenopodiaceae gehören, benötigen ebenfalls eine räumliche Kompartimentierung der Kohlenstoff-Assimilation und -Decarboxylierung (Chuong et al. 2006). Diese Arten haben dimorphe Chloroplasten in diesen Kompartimenten. Die früheren Versuche führten zu einem erfolglosen Zyklus, was darauf zurückzuführen war, dass sich die Anatomie nicht veränderte, keine geeigneten Transporter vorhanden waren und die in Reis transformierten Maisgene nicht in geeigneter Weise zellspezifisch exprimiert und nicht wie in Mais, sondern wie die endogenen C3-Isoformen von Reis reguliert wurden (Miyao et al. 2011).

Um den Photosyntheseweg innerhalb von zwei Jahrzehnten von C3 auf C4 umzustellen, was in der Natur Millionen von Jahren dauerte, begann das C4-Reiskonsortium mit der gleichzeitigen Entdeckung von Genen und dem Einbau bereits bekannter Gene in Reis mit dem Ziel, C4-Reis mit einer Anatomie vom Kranz-Typ zu bilden. C4-Gene wie CA, PEPC, PPDK, NADP-ME und NADP-MDH wurden aus Mais geklont und in Reis transformiert. Auch die Transporter, die in den C4-Stoffwechselwegen überexprimiert wurden, wie der 2-Oxoglutarat/Malat-Transporter (OMT1), der Dicarboxylat-Transporter1 (DiT1), der Dicarboxylat-Transporter2 (DiT2), der PEP/Phosphat-Transporter (PPT1), das Mesophyll-Hüllprotein (MEP) und der Triose-Phosphat-Phosphat-Translokator (TPT), die vor kurzem durch Proteomik in BS- und MS-Zellen von Mais identifiziert wurden (Friso et al. 2010), werden in Reis transformiert (Abbildung 3). Die Mitglieder des C4-Reiskonsortiums sind auch an der Entdeckung neuer Gene beteiligt, die mit der Kranz-Anatomie zusammenhängen (Wang et al. 2013b). Sobald sie getestet sind, werden die vielversprechenden Kandidatengene, die die Kranz-Anatomie kontrollieren, auch in die Reispflanzen eingebracht, die mit den Genen für den biochemischen C4-Weg ausgestattet wurden.