Está en el aeropuerto consumiendo el tiempo con un informe que debe entregar mañana por la mañana a su profesor. Usted tiene sus datos. ¿Por qué no aprovechar el tiempo y calcular el cambio en el pliegue de expresión de los genes que has analizado en ese primer experimento de qPCR que hiciste la semana pasada?
Es fácil – te mostraré cómo.
Comprueba tu método
Hay dos formas principales de analizar los datos de qPCR: el análisis de doble delta Ct y el método de la curva estándar relativa (método Pfaffl). Ambos métodos hacen suposiciones y tienen sus limitaciones, por lo que el método que debe utilizar para su análisis dependerá de su diseño experimental.
El análisis de doble delta Ct asume que:
- hay una eficiencia de cebador igual entre los conjuntos de cebadores (es decir dentro del 5%);
- hay una eficacia de amplificación cercana al 100% de los genes de referencia y de los genes diana;
- los genes de control interno se expresan constantemente y no se ven afectados por el tratamiento.
El método generalmente abastece a los experimentos con un gran número de muestras de ADN y un bajo número de genes a analizar.
El método de la curva estándar relativa asume que:
- hay eficiencias iguales entre las muestras de control y las tratadas.
Este método funciona mejor si se tienen menos muestras de ADN pero un mayor número de genes que probar.
Lo que necesita para el análisis Ct doble delta
- Valores Ct de la qPCR (datos brutos) para:
- el gen de mantenimiento de la casa: condiciones de control y experimentales;
- el gen de interés: condiciones de control y experimentales;
- Una hoja de cálculo de Excel.
¡Y ya está! No se necesita ningún software caro.
Aquí hay un resumen rápido de los pasos clave en el análisis de Ct doble delta (para una explicación detallada lea este documento).
4 pasos para el análisis de Ct doble delta
1. Tome el promedio de los valores Ct para el gen de mantenimiento y el gen que se está probando en las condiciones experimentales y de control, devolviendo 4 valores. Los 4 valores son Gene being Tested Experimental (TE), Gene being Tested Control (TC), Housekeeping Gene Experimental (HE), y Housekeeping Gene Control (HC).
| Valor Ct Experimental Medio | Valor Ct Experimental Medio | Valor Ct Control Medio | Valor Ct Control Medio | \DeltaCt Valor (Experimental) | \DeltaCt Valor (Control) |
|---|---|---|---|---|---|
| TE | HE | TC | HC | \DeltaCTE | \DeltaCTC |
| 21.27 | 20,23 | 19,60 | 19,27 | 1,03 | 0,33 |
2. Calcule las diferencias entre los valores experimentales (TE – HE) y los valores de control (TC – HC). Estos son sus valores \DeltaCt para las condiciones experimentales (\DeltaCTE) y de control (\DeltaCTC), respectivamente.
3. Luego, calcule la diferencia entre los valores \DeltaCT para las condiciones experimentales y de control (\DeltaCTE – \DeltaCTC) para llegar al valor doble delta Ct (ddCt).
4. Como todos los cálculos están en logaritmo base 2, cada vez que hay el doble de ADN, sus valores Ct disminuyen en 1 y no se reducen a la mitad. Tienes que calcular el valor de 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} para obtener la expresión fold change.
| Valor Ct (Experimental) | Valor Ct (Control) | Valor Ct | Cambio de pliegue de expresión |
|---|---|---|---|
| dCTE | dCTC | ddCt | 2^-ddCt |
| 1.03 | 0,33 | 0,70 | 0,615572207 |
¿Qué significa el valor?
Ahora que tiene su valor para el cambio de pliegue, ¿qué significa realmente? Este valor es el cambio de pliegue de su gen de interés en la condición de prueba, en relación con la condición de control, que se ha normalizado a su gen de mantenimiento.
Para hacerlo un poco más claro – usted puede pensar en ello como un porcentaje. Un cambio de pliegues de 1 significa que hay un 100% de expresión génica en su condición de prueba como en su condición de control – por lo que no hay cambio entre el grupo experimental y el grupo de control. Un valor de cambio de pliegues superior a 1 muestra una regulación superior del gen de interés en relación con el control (cambio de 1,2 veces = 120% de expresión génica en relación con el control, 5 = 500%, 10 = 1.000%, etc.). Los valores por debajo de 1 son indicativos de una regulación a la baja del gen en relación con el control (un cambio de pliegue de 0,5 es un 50% de expresión del gen en relación con el control, es decir, la mitad de expresión que en el control, etc.).
Puede presentar estos datos como gráficos de barras de cambio de pliegue, graficando las condiciones de control iguales a 1. También puede utilizar análisis estadísticos para comprobar la importancia de los cambios, por ejemplo, utilizando un análisis de la varianza (ANOVA) o pruebas t, lo que sea apropiado para su configuración experimental.
Usando estos pasos puede llevar a cabo su análisis qPCR donde quiera que esté, incluso si está de viaje. Para facilitar aún más las cosas, puede crear una plantilla de Excel para utilizarla cada vez. Así, solo tendrá que introducir sus datos y asombrará a los demás con su presteza en la realización de los análisis!
Publicado originalmente el 9 de julio de 2016. Revisado y actualizado el 8 de febrero de 2021.
Las lecturas adicionales
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2^{-2\Delta\Delta C_{t}} Method. Methods. 2001;25:402-8.
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