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Por G.P. Thomas15 de abril de 2013

Créditos de la imagen: khawfangenvi16/.com

La cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía líquida de alta presión (HPLC) es un método cromatográfico que se utiliza para separar una mezcla de compuestos en química analítica y bioquímica con el fin de identificar, cuantificar o purificar los componentes individuales de la mezcla.

La HPLC de fase inversa o cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) es un modo de separación comúnmente utilizado. Proporciona una retención dinámica de los compuestos que poseen funcionalidad hidrofóbica y orgánica. Una combinación de interacciones hidrofóbicas y de tipo van der Waals entre todo el compuesto objetivo y tanto la fase estacionaria como la fase móvil permite la retención de estos compuestos por fase inversa.

¿Cómo funciona la HPLC?

En cantidades muy pequeñas, la mezcla de la muestra que se va a separar y analizar se envía a una corriente de fase móvil que se filtra a través de una columna. Existen diferentes tipos de columnas con sorbentes de diferentes tamaños de partícula y superficies.

La mezcla se mueve a través de la columna a diferentes velocidades e interactúa con el sorbente, también conocido como fase estacionaria. La velocidad de cada componente de la mezcla depende de 1) su naturaleza química, 2) la naturaleza de la columna y 3) la composición de la fase móvil. El tiempo en el que un analito específico emerge de la columna se denomina tiempo de retención. El tiempo de retención se mide en condiciones específicas y se considera la característica de identificación de un analito determinado.

Las partículas absorbentes pueden ser de naturaleza hidrofóbica o polar. Las fases móviles comúnmente utilizadas incluyen cualquier combinación miscible de agua y disolventes orgánicos como el acetonitrilo y el metanol. También pueden utilizarse fases móviles sin agua.

El componente acuoso de la fase móvil puede contener ácidos como el fórmico, el fosfórico o el trifluoroacético o sales para permitir la separación de los componentes de la muestra. La composición de la fase móvil se mantiene constante o se varía durante el análisis cromatográfico. El enfoque constante es eficaz para la separación de los componentes de la muestra que no son muy diferentes en su afinidad por la fase estacionaria. En el enfoque variado, la composición de la fase móvil difiere de una fuerza de elución baja a una alta. La fuerza de elución de la fase móvil se refleja en los tiempos de retención del analito, donde una fuerza de elución alta produce una elución rápida.

La composición de la fase móvil se elige en función de la intensidad de las interacciones entre varios componentes de la muestra y la fase estacionaria.

El proceso de partición por HPLC es bastante similar al proceso de extracción líquido-líquido, excepto que el primero es un proceso continuo, a diferencia del segundo, que es un proceso por etapas. Se recomienda realizar procesos de partición de prueba para determinar el método exacto de HPLC que proporcionaría una separación adecuada.

Fabricantes de sistemas de HPLC

Hay una amplia gama de opciones de HPLC en el mercado actual. A continuación se ofrece una lista de varios fabricantes de sistemas HPLC con una breve introducción de sus productos:

• Dionex, una empresa basada en la ciencia de la cromatografía, fabrica el sistema UltiMate® 3000 Rapid Separation LC, el sistema UltiMate 3000 RSLCnano y la familia Corona® de detectores universales de aerosoles cargados.
• Jasco Analytical Instruments ofrece una gama de sistemas HPLC. Los sistemas HPLC de la serie LC-2000 Plus tienen una configuración única. Con un alto rendimiento y un bajo coste, estos sistemas HPLC pueden adaptarse a prácticamente cualquier requisito, desde el simple control de calidad isocrático hasta el desarrollo avanzado de métodos multisolventes/multicolumnas. El LC-2000plus-Iso isocrático se suministra con una bomba, un desgasificador, un automuestreador y un detector UV/Vis. La bomba está diseñada con caudales de 1µL a 10mL/min a presiones de hasta 500 bar para su uso con columnas de 2, 3, 4, 6 y hasta 10mm de ID. El Gradiente Binario LC-2000plus-HPG es similar al sistema isocrático pero está provisto de una configuración de bomba de gradiente de dos disolventes. Los caudales de la bomba son compatibles con columnas de 1 mm. El sistema de gradiente cuaternario LC-2000plus-LPG también es similar al sistema isocrático; sin embargo, este modelo está provisto de una configuración de bomba de gradiente cuaternario para una máxima flexibilidad de disolventes.
• El sistema de HPLC preparativa de Gilson tiene un amplio rango de flujo que puede adaptarse tanto para separaciones semipreparativas como preparativas. Su alta potencia de bombeo permite una amplia gama de tamaños de columna preparativa. El sistema está diseñado con un nuevo sistema de estación de enjuague que comprende un lavado de chorro fluyente y permite el uso de hasta dos disolventes de enjuague diferentes.
• Los sistemas HPLC Sharp™ de AAPPTec están provistos de bombas controladas por microprocesador, lo que permite obtener caudales muy precisos y de gran exactitud, que pueden ayudar a obtener una excelente reproducibilidad analítica y la máxima exactitud de las mediciones.

Otros fabricantes del mercado actual son Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad y Buck Scientific.

Beneficios de la HPLC

Los principales beneficios de los sistemas HPLC son los siguientes:

• Controlan y automatizan la instrumentación cromatográfica
• Proporcionan gestión de datos, funciones de seguridad y presentación de informes y validación de instrumentos.
• Potente y adaptable
• Aumenta la productividad gestionando todas las áreas de análisis – desde la muestra hasta el instrumento, y desde la separación hasta el informe de resultados.
• Asequible

Aplicaciones de la HPLC

El objetivo principal de la técnica HPLC es identificar, cuantificar y purificar un determinado analito o compuesto. Se puede realizar un análisis tanto cuantitativo como cualitativo. Los HPLC pueden utilizarse en las siguientes aplicaciones:

• Purificación de agua
• Detección de impurezas en industrias farmacéuticas
• Preconcentración de componentes traza
• Cromatografía de intercambio de ligandos
• Cromatografía de intercambio iónico de proteínas
• Cromatografía de intercambio aniónico de alta pH
• .de hidratos de carbono y oligosacáridos

Fuentes y lecturas adicionales

• Cromatografía de fase inversa HPLC/UHPLC-Phenomenex
• Productos Dionex-Dionex
• Sistemas de HPLC-aapptec
• Sistema de HPLC preparativa-Gilson

Este artículo fue actualizado el 22 de abril, 2019.

Escrito por

G.P. Thomas

Gary se graduó en la Universidad de Manchester con una licenciatura de primera clase en Geoquímica y un máster en Ciencias de la Tierra. Tras trabajar en la industria minera australiana, Gary decidió colgar las botas de geólogo y dedicarse a escribir. Cuando no está elaborando contenidos de actualidad e informativos, a Gary se le suele encontrar tocando su querida guitarra, o viendo cómo el Aston Villa FC arrebata la derrota de las fauces de la victoria.

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