Resultados
La visualización del AMPc en el cilio primario de las células vivas mediante biosensores fluorescentes presenta varios retos únicos. En primer lugar, los cilios son pequeños y delgados, y sobresalen de 2 a 10 µm por encima de la superficie de la célula; en segundo lugar, aunque no son móviles, están sujetos al movimiento debido al flujo de masa en la solución de baño, y en tercer lugar, las señales ciliares de buena fe pueden ser difíciles de separar ópticamente de la fluorescencia de fondo que emana del cuerpo celular. Aunque ya se han descrito varios reporteros de AMPc dirigidos a los cilios (19, 24, 25), nosotros intentamos generar biosensores ratiométricos con mayor brillo y fidelidad de orientación. Después de probar numerosos diseños, descubrimos que las sondas basadas en Epac de cuarta generación del laboratorio de Kees Jalink (EpacH188 y una versión de mayor afinidad, EpacH187) (26), combinadas con Arl13b, una proteína altamente localizada en los cilios, ofrecían la mejor orientación, brillo y sensibilidad (27) (Fig. 1A). Los sensores que incorporan el receptor 5-HT6 dieron una localización comparativamente buena como las sondas acopladas a Arl13b; sin embargo, como se discute más adelante, los receptores 5-HT6 no localizados en los cilios causaron una elevación del AMPc celular debido a la conocida actividad constitutiva de este GPCR (28).
Señalización de AMPc en los cilios de células permeabilizadas con digitonina. Todos los experimentos se realizaron en tampón intracelular suplementado con ATP y GTP. (A) Las células mIMCD3 que expresan 5-HT6-mCherry y Arl13b-H187 localizados tanto en la célula como en el cilio no respondieron a 10 µM de 5-HT en el cuerpo de la célula o en el cilio tras 2 minutos de tratamiento con 20 μg/mL de digitonina (4 experimentos, 5 cilios). (B) De forma similar, la capacidad de respuesta al agonista inverso, 1 µM SB742457, y la subsiguiente respuesta de rebote de 5-HT6 se perdieron tanto en la célula como en el cilio después de 2 min de tratamiento con 20 μg/mL de digitonina (3 experimentos, 3 cilios). (C) La permeabilización con digitonina anuló la señal de AMPc inducida por forskolina 50 µM en los cuerpos celulares, pero el aumento de AMPc fue detectable en los cilios; la inhibición de la PDE inducida por IBMX 1 mM no desenmascaró ninguna señal (n = 4 experimentos con 4 cilios/7 células). (D) La cotransfección de AC3 no cambió la respuesta a la forskolina. (E) Cuantificación y comparación de la respuesta del AMPc a la forskolina en los cuerpos celulares y en los cilios; **P = 0,0002, ***P = 00019. Trazos azules = cuerpo celular, trazos rojos = cilios. Barras de tiempo: 3 min. El eje y es la relación 480/535 nm.
Una explicación obvia de la falta de efecto en los experimentos anteriores fue que el AMPc no se acumuló lo suficiente como para ser captado por el reportero. Sin embargo, cuando se repitió el mismo experimento utilizando forskolina para activar directamente las ACs endógenas (adenilil ciclasas) presentes en la membrana ciliar, se detectó una pequeña pero consistente acumulación de AMPc en el microambiente del cilio pero no en el cuerpo celular (Fig. 4 C y E, gráficos de barras de la izquierda). Se obtuvieron resultados similares en las células que expresaban AC3 (36) (Fig. 4 D y E, gráficos de barras de la derecha), que se localizó en los cilios cuando se expresó en las células mIMCD3 (Apéndice SI, Fig. S8). Asumiendo que la permeabilización no condujo a la pérdida de componentes esenciales de la maquinaria de señalización del GPCR, el pequeño pero detectable cambio tras la adición de forskolina sugiere que debería haber sido posible resolver las señales de AMPc dependientes del GPCR si tuvieran lugar en el cilio. Estos datos también indican que la membrana ciliar de las células mIMCD3 quedó intacta tras el tratamiento con digitonina.
Los datos anteriores nos dejan con la pregunta de por qué los GPCRs no son competentes para producir AMPc una vez secuestrados en el cilio. Estudios anteriores han citado la entrada de Ca2+ a través de la membrana ciliar como un importante regulador del AMPc del orgánulo debido a la presencia de canales conductores de Ca2+ específicos de los cilios (PKD2L1 y PKD2) y de ACs regulados por Ca2+ (AC1, 8, 5 y 6) (11, 16, 23, 32, 37). Se ha informado que los cilios primarios de las células mIMCD3 albergan AC5 y/o AC6 inhibibles por Ca2+ (10). Por lo tanto, consideramos que la alta permeabilidad en reposo y al Ca2+ del cilio (38, 39) podría explicar la inactivación de las ACs acopladas al receptor 5-HT6. Para abordar mejor este punto, mejoramos el sensor sustituyendo la secuencia de orientación Arl13b por un receptor 5-HT6 funcional para dirigir la fusión reportero-GPCR de AMPc directamente al cilio (5-HT6-EpacH187). En consonancia con los datos de las Figs. 3I y 4C, cuando se dirigió exclusivamente al cilio, la 5-HT no produjo una señal de AMPc medible (Fig. 5A). La exposición de las células a soluciones nominalmente libres de Ca2+ no rescató la respuesta de la 5-HT en los cilios (Fig. 5B), indicando que la entrada de Ca2+ a través de la membrana ciliar no suprimió la señal. Consideramos que quizás la expresión de 5-HT6 alteraba la distribución ciliar de la proteína Gαs en las células mIMCD3, pero los experimentos de inmunotinción sugirieron que no era así (Apéndice SI, Fig. S9). Sin embargo, cuando probamos el efecto de 5-HT en células pretratadas con SAG (250 nM a 1 µM) para activar los receptores Smo (40), pudimos restaurar la capacidad de respuesta del receptor 5-HT6 al agonista (Fig. 5C). La sensibilidad al agonista inverso también fue evidente, lo que implica la restauración de la actividad constitutiva (Fig. 5D).
La activación de la vía Hedgehog aumenta la respuesta de AMPc reportada por 5-HT6-Epac-H187 a 5-HT y dopamina en cilios primarios: (A) En consonancia con los datos de las Figs. 3I y 4C, las células mIMCD3 no respondieron a 10 µM de 5-HT cuando la fusión sensor/receptor se limitó estrictamente a la membrana ciliar (6 experimentos, 6 cilios). (B) La atenuación de la alta en los cilios mediante la colocación de las células en una solución nominalmente libre de Ca2+ no rescató la señalización de AMPc estimulada por 5-HT (5 experimentos, 6 cilios). (C) Tras un pretratamiento de una noche con 1 µM de SAG, 5 de los 6 cilios (6 experimentos) respondieron a la estimulación de la 5-HT (**P = 0,000992). (D) El pretratamiento con 1 µM de SAG rescató la respuesta a 1 µM de SB742257 (-35,5 ± 11,2% por debajo de la línea de base en relación con el posterior aumento de AMPc provocado por 10 µM de 5-HT; típico de 4 experimentos, 4 cilios). (E) Un aumento de AMPc en los cilios de NIH 3T3 (típico de 9 experimentos, 11 cilios) fue provocado por 10 μM de 5-HT. (F) El pretratamiento nocturno con 1 μM de SAG aumentó significativamente la respuesta a la 5-HT (**P = 0,00034; 6 experimentos, 7 cilios). El pretratamiento nocturno con 10 μM de ciclopamina (Cyclo) tuvo un efecto insignificante (8 experimentos, 9 cilios, gráfico de barras). (G y H) La somatostatina (SST) de 100 nM atenuó la respuesta de 5-HT en los cilios que albergaban SSTR3-GFP con y sin pretratamiento de SAG (G: 5 experimentos, 6 cilios; H: 2 experimentos, 5 cilios). (I y J) El pretratamiento con SAG aumentó la respuesta a la dopamina (DA) a 10 nM (I: 4 experimentos, 4 cilios, J: 4 experimentos, 6 cilios, **P = 0,002476). Trazos azules, cuerpo celular; trazos rojos, cilios. Barras de tiempo: 3 min. El eje y es la relación FRET 480/535 nm. Los gráficos de barras indican la respuesta de 5-HT o DA como porcentaje de la respuesta de forskolina/IBMX; las barras de error representan el SEM.
Los resultados anteriores nos dejaron con la pregunta de si la inesperada regulación ascendente dependiente de SAG del receptor 5-HT6 expresado en las células mIMCD3 era específica del tipo celular y/o del GPCR. A diferencia de mIMCD3, la estimulación de células 3T3 (Fig. 5E) y MEFs (Apéndice SI, Fig. S10A) con 5-HT produjo un cambio de proporción medible que fue, sin embargo, significativamente aumentado tras el tratamiento con SAG (Fig. 5F y Apéndice SI, Fig. S10B). Curiosamente, el antagonista del receptor de la serotonina, la ciclopamina, que podría esperarse que tuviera el efecto opuesto de SAG, no abolió la señalización de AMPc estimulada por 5-HT en los cilios primarios de las células 3T3 (gráfico de barras, Fig. 5F).
Usando este sistema, también pudimos evaluar la capacidad de un GPCR ciliar acoplado a Gαi, SSTR3, para revertir las señales de AMPc estimuladas por la serotonina en el cilio. El tratamiento de las células 3T3 que coexpresan SSTR3-GFP y 5-HT6-H187 con somatostatina revirtió las respuestas de 5-HT a la línea de base en 2 minutos en presencia y ausencia de tratamiento con SAG (Fig. 5 G y H), indicando el control local de la función 5-HT6. A continuación, comprobamos cómo el SAG afectaba a la actividad de otro GPCR ciliar acoplado a Gαs, el receptor de dopamina D1R (5). Se coexpresó D1R-EGFP con 5-HT6-H187 en células 3T3, y se seleccionaron las células con fluorescencia sólo en los cilios. Diez nanomolares de dopamina produjeron pequeñas pero medibles señales de AMPc en las células de control (Fig. 5I), y de nuevo, la señal fue significativamente mayor después del tratamiento con SAG (Fig. 5J; resumido en el gráfico de barras).